泡球蚴感染C57BL/6小鼠肝臟CD34表達的動態(tài)變化

，，，，，，，，，

泡狀棘球蚴病(AE)簡稱泡球蚴病，是由多房棘球絳蟲的幼蟲寄生于人體從而引發(fā)的一種罕見的人畜共患寄生蟲病，主要侵犯在肝臟[1-2]。泡球蚴主要通過直接侵蝕、炎癥刺激、機械性擠壓等方式損害肝組織，以外生性出芽增殖的方式長出新囊泡，然后長入組織內(nèi)部并最終逐漸波及整個肝臟[3]。Hanahan[4]等研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤血管新生過程中會受到“血管生成開關”的調(diào)節(jié)。CD34是一種高度糖基化跨膜細胞表面的糖蛋白，可通過造血干細胞和祖細胞表達[5]，是血管內(nèi)皮標記物中標記腫瘤新生血管的指標，具有穩(wěn)定性和敏感性好的特點[6]。CD34具有血管新生和遷移的生物學功能，因此，被稱為“泛血管內(nèi)皮細胞標記物”，微血管密度(MVD)是研究腫瘤血管新生常見的指標之一。本研究通過檢測CD34-MVD的表達及動態(tài)變化，初步探討血管新生與泡球蚴病程發(fā)展的相關性，為以后臨床治療泡型包蟲病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1動物與分組 實驗用種鼠是人工腹腔感染原頭節(jié)混懸液18周的子午沙鼠由新疆維吾爾自治區(qū)疾控中心提供，實驗用健康清潔型的C57BL/6雌性小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量(18±2)g，購于新疆醫(yī)科大學實驗動物中心。運用數(shù)字表法將小鼠隨機分成兩組：實驗組20只，對照組20只。

1.2主要試劑與儀器 CD34兔抗單克隆抗體購于英國Abcam公司，即用型免疫組化試劑盒購于北京中杉金橋生物公司，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑和抗體稀釋液均購于丹麥Dako公司。組織自動包埋機(Leica EG1160)及石蠟切片機(Leica 2245)均來自德國Leica公司。光學顯微鏡(CX31RBSF)為日本Olympus公司產(chǎn)品，圖像采集系統(tǒng)(ExwaveHAD)為日本SONY公司產(chǎn)品。

1.3建立模型及標本采集 將人工腹腔感染原頭節(jié)混懸液18周的子午沙鼠快速處死，無菌操作并剖腹，取出腹腔中泡球蚴組織，選擇光滑、成簇游離于腹腔或附著在腸系膜、肝表面等部位的泡球蚴組織。用生理鹽水反復沖洗后，將病灶組織剪碎、研磨、過篩網(wǎng)，再用生理鹽水反復漂洗，最終配成濃度為20%的原頭節(jié)混懸液。用0.5%伊紅染色見泡狀棘球蚴原頭節(jié)3～5個/視野，結構清晰，著色率<15%，加青霉素、鏈霉素注射液各250 u/mL，用于動物接種。將40只C57小鼠麻醉，酒精消毒上腹部皮膚，開腹約0.5 cm，肉眼直視下1號針頭左肝葉穿刺，實驗組注入0.1 mL原頭節(jié)混懸液/只(約400只活的原頭節(jié))，對照組注入等量0.1 mL PBS溶液/只，絲線縫合后關閉腹腔，烤燈照射等待復蘇，醒后先禁食12 h，然后恢復正常飲食，飼養(yǎng)于清潔級動物房。分別于感染后30 d、60 d、90 d、120 d每組隨機取5只小鼠，實驗組取病灶及病灶周圍肝組織，對照組取相應部位肝組織。

1.4病理組織學觀察 將上述組織標本置于10%的多聚甲醛溶液固定24～48 h后，梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟及石蠟包埋。5 m厚度連續(xù)切片。HE染色，光學顯微鏡下觀察各標本組織病理學改變。

1.5免疫組織化學染色檢測CD34的表達 將制備好的石蠟切片烤箱復溫，脫蠟至水化，枸櫞酸緩沖液(pH=6.0)高壓修復10 min,自然冷卻至室溫。然后3%H2O2溶液室溫孵育10 min,1×PBS振洗(5 min×3次)，每個標本滴加約50 μL一抗稀釋液(CD34工作濃度為1∶2 500)，4 ℃冰箱孵育過夜。次日溫箱復溫后1×PBS振洗(5 min×3次)，每張切片滴加約50 μL二抗稀釋液，溫箱孵育30 min后，1×PBS振洗(5 min×3次)，DAB顯色，蘇木素復染，酸酒精分化，自來水藍化，脫水，透明，自然晾干切片后封片并做好標記。陰性對照用PBS替代一抗，陽性對照用人乳腺癌組織。

2 結 果

2.1肝臟大體觀察 小鼠感染泡球蚴后，30 d時可見直徑約3 mm的乳白色結節(jié)狀泡球蚴組織，形態(tài)不規(guī)則；60 d泡球蚴體積略有增大，在肝葉邊緣生長；90 d時一側(cè)肝葉和第一肝門臟面兩處可見明顯的不規(guī)則的長條狀組織；120 d時，泡球蚴組織較之前明顯增長，并向肝組織內(nèi)部不斷滲入，呈浸潤性生長，表現(xiàn)為結節(jié)性或巨塊型。對照組小鼠肝臟無明顯改變。

圖1 不同時間點小鼠肝臟泡球蚴感染情況 (黑色箭頭所指為泡球蚴組織)Fig.1 Infection conditions of different time points in Em-infected livers of mice (The black arrows indicated Em tissues)

2.2病理組織學 HE染色顯示實驗組小鼠感染泡球蚴30 d后出現(xiàn)外周炎性反應增生帶，伴有嗜酸性粒細胞浸潤、結核樣肉芽組織形成和纖維組織增生，并可見數(shù)個原頭節(jié)；感染60 d可見炎性細胞浸潤逐漸加重，外周區(qū)域增生較為活躍，向周圍肝組織侵蝕，肝臟原有組織結構部分被破壞；感染90 d時炎性反應增生帶不斷擴增，炎性細胞浸潤愈加嚴重，出現(xiàn)與淋巴細胞、巨噬細胞、漿細胞和嗜酸性粒細胞等炎性浸潤相關的細胞增殖；感染120 d后可見泡球蚴纖維囊壁形成，囊壁周圍可見大量的炎性反應增生和肉芽腫組織，直徑約1 cm的壞死空囊腔已形成，外周炎性增生帶進一步蔓延，肝臟病理性改變嚴重。對照組小鼠肝組織結構基本完整，肝細胞形態(tài)正常，偶可見少量炎性細胞浸潤。

A:實驗組，B：對照組

2.3免疫組織化學染色 在不同時間點，實驗組肝泡球蚴病變組織中均可見CD34不同程度的表達，陽性定位于泡球蚴組織內(nèi)皮細胞的包漿。隨著感染時間的延長，實驗組泡球蚴組織CD34的表達呈時間相關性，表現(xiàn)為先升高后下降的趨勢，在90 d時CD34-MVD最高，各時間點比較差異有統(tǒng)計學意義(F=94.63,P<0.001)。在泡球蚴周圍肝組織中可見微量表達，差異無統(tǒng)計學意義(F=3.24,P>0.05)，圖A2示泡球蚴組織炎性反應帶和周圍肝組織交界區(qū)域，可形成明顯的反差。在對照組中亦可見微量表達，組內(nèi)比較無統(tǒng)計學差異(F=1.98,P>0.05)。泡球蚴組和泡球蚴周圍組、對照組三組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而泡球蚴周圍組和對照組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表1。

A1:實驗組Em組織；A2:實驗組Em周圍肝組織；B:對照組

表1 不同時間點不同肝組織CD34-MVD的表達情況(個Tab.1 Expression of CD34-MVD in different time points of different liver tissues

3 討 論

泡狀棘球蚴病又稱為泡型包蟲病,其生長方式除了直接浸潤以外，還可通過血液循環(huán)、淋巴等途徑轉(zhuǎn)移至肺臟、腦等器官，危害極大，泡球蚴的轉(zhuǎn)移方式類似惡性腫瘤，故有“蟲癌”之稱[3，8]。惡性腫瘤的生長離不開營養(yǎng)的支持，需要血管來輸送，所以血管新生在腫瘤生長、侵襲及轉(zhuǎn)移中起著重要作用[9]。

CD34是高度糖基化的I型跨膜蛋白，是其家族成員之中的一種單體表面蛋白，可作為檢測MVD的首選標志物[10]。CD34被廣泛認為是血管內(nèi)皮祖細胞(EPCs)的標記物[11]， 而EPCs是促進血管新生的重要干細胞之一。Siemerink M J[12]等研究表明：mRNA分析顯示CD34陽性的血管內(nèi)皮細胞與血管新生和遷移等生物學功能有關；CD34陰性的血管內(nèi)皮細胞主要與增殖相關，該結果說明CD34在血管新生中有促進作用。 Sarmadi S[13]等認為CD34可標記宮頸癌的MVD。另外，CD34+干細胞可促進血管新生[14]；張示杰[15]等研究結果顯示：沙鼠肝泡球蚴組織中CD34-MVD存在不同程度的表達。

本研究結果顯示，在小鼠肝臟感染泡球蚴后，隨著時間延長，其病變部位CD34-MVD的表達高于泡球蚴周圍肝組織和PBS對照組肝組織，且差異均有統(tǒng)計學意義,此結果表明在泡球蚴浸潤性生長過程中血管新生可能是存在的，并且是不斷變化的。通過對實驗組泡球蚴組織內(nèi)比較可知，隨著病程的發(fā)展，CD34的表達水平有所不同。在感染早中期，泡球蚴組織內(nèi)新生血管可能不斷增加,在感染晚期，隨著泡球蚴病程的發(fā)展，其病變部位CD34-MVD呈現(xiàn)降低趨勢，并且在組織內(nèi)部可見壞死組織和空囊泡，其原因可能與血管壁慢性炎癥以及管壁內(nèi)膜增厚導致的血流受阻有關，壞死原因可能是囊內(nèi)毒素外溢、抗原抗體反應所造成的[16]。Dematteis S[17]、Wang J[18]等學者研究表明，在棘球蚴感染早期，Th1細胞占主導，淋巴細胞功能較強，對棘球蚴的生長和轉(zhuǎn)移有抑制作用；到后期，Th2細胞占主導，淋巴細胞功能逐漸降低，細胞免疫反應受到抑制，故包蟲可在體內(nèi)生存，增殖速度加快。本實驗研究泡球蚴生長變化與其基本符合，即早期增長相對緩慢，晚期增長較為迅速，但仍需大樣本研究進一步證實。可見在感染中期(90d)是免疫過渡期，即為機體免疫應答由Th1細胞介導的細胞免疫轉(zhuǎn)變?yōu)門h2細胞介導的體液免疫[19]。由上可知，泡球蚴在感染早期，可能由于新生血管的不斷增加，有營養(yǎng)供應，但是由于Th1的作用較強，對其生長和轉(zhuǎn)移有抑制作用，故蟲體增長不明顯；而在中晚期，Th2作用逐漸變強，宿主對其抑制作用減弱，雖然新生血管減少，但也能夠維持蟲體長期生長，同時肝臟大量分泌的TGF-β1促進肝纖維化后包裹蟲體，有助于泡球蚴免疫逃逸[20]。

總之，本實驗研究表明，小鼠肝泡球蚴感染病程中，CD34的表達呈先升高后降低趨勢，并且在90d時達到峰值，這說明在泡球蚴生長過程中很可能伴隨著血管新生，血管新生可能為其生長重要的機制之一,同時，MVD可能在泡球蚴病程中起著重要作用。本研究為臨床泡型包蟲病的抗血管化治療奠定了基礎。