高效降解茶皂素菌株的分離鑒定及其發酵優化研究

任澤文 肖志紅 吳 紅 張愛華 趙夢瑞 彭映輝 黎繼烈

(中南林業科技大學生物技術湖南省重點實驗室1，長沙 410004) (湖南省林業科學院2，長沙 410004) (湖南糧食集團有限責任公司3，長沙 410083) (南開大學化學院4，天津 300071)

油茶(Camelliaoieifera)，山茶科山茶屬，為常綠小喬木或灌木，是我國南方主要的一種木本食用油料樹種[1]。油茶加工后產生了大量的油茶餅粕，未能得到充分的利用[2]。油茶餅粕營養豐富，蛋白質質量分數大于15%，適合作為微生物發酵的基質[3-5]。油茶餅粕中的茶皂素質量分數一般在15%～25%，還存在少許的單寧、植酸等抗營養成分，導致其在飼料方面的應用受到一定的限制[6]。因此，尋求一種高效、安全的降解油茶餅粕中茶皂素的新方法尤為重要。利用微生物降解油茶餅粕中的茶皂素具有安全、高效、環保的優點，因此越來越受到研究人員的關注。目前，國內已有部分細菌和真菌被應用于茶皂素的降解研究上，如地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和桔青霉(Penicilliumcitrinum)等菌種，降解率在60%～75%之間[7-11]。本研究旨在篩選到能夠更高效降解茶皂素的菌株，探究其固態發酵降解油茶餅粕中茶皂素的條件，為提高油茶餅粕的利用提供參考。

1 材料與方法

1. 1 材料

油茶餅粕：湖南省林業科學院提供，105 ℃烘干粉碎后過40目篩，茶皂素含量為13.8%；

1.1.1 培養基

真菌分離培養基[12]：葡萄糖2%,瓊脂2%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O 0.1%，鏈霉素30μg/mL，pH自然。

PDA培養基：去皮馬鈴薯200 g, 葡萄糖20 g,瓊脂15～20 g,蒸餾水1 000 mL,pH自然。

PDA液體培養基：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然(添加20顆小玻璃珠)。

油茶餅粕發酵培養基：30 g油茶餅粕，24 mL蒸餾水，pH自然。做法：30 g油茶餅粕添加24 mL蒸餾水在不銹鋼盆子里拌勻并覆蓋一層保鮮膜，靜置30 min，使油茶餅粕與水混合均勻后裝進組培瓶中，121 ℃滅菌20 min。

1.1.2 試劑與儀器

無水乙醇、香草醛、濃硫酸、氯化鈉等均為分析純；真菌DNA試劑提取盒；CJ-1D潔凈工作臺；高速萬能粉碎機；SPX智能型培養箱；電熱鼓風干燥箱；自動高壓滅菌鍋；PHS-3C精密酸度計；V-5100型紫外可見分光光度計。

1.2 實驗方法

1.2.1 茶皂素含量及其分析方法

茶皂素的提取方法采用微波輔助法[13]，測量方法采用香草醛-濃硫酸顯色法[14]。

1.2.2 降解茶皂素菌種的篩選

初篩：取自然發酵的油茶粕，準確稱取10 g樣品用90 mL無菌水稀釋并震蕩20 min，梯度稀釋涂布到分離培養基上，30 ℃培養3 d，根據單菌落大小、表面結構、質地、光澤和顏色等特征，挑選形態特征差異明顯的單菌落進行劃線純化，編號并保存。

復篩：將實驗所得菌株接種于PDA液體培養基中，30 ℃培養1 d后接種至油茶餅粕培養基中，30 ℃固態靜置發酵,發酵72 h后測量茶皂素的含量，計算其降解率，并判斷菌株降解茶皂素能力的強弱。

1.2.3 菌株的鑒定

1.2.3.1 菌株的形態學鑒定

按照《真菌鑒定手冊》[15]和《中國真菌志》[16]的方法，將L-2菌株的孢子接種于PDA培養基平板上，30 ℃培養，分別于第 5天和第 10天觀察菌落的顏色、質地、表面紋飾和生長速度等特征。

1.2.3.2 菌種的ITS鑒定

從 PDA培養基上輕輕刮取培養5 d左右的菌落邊緣菌絲體5 mg，將其用液氮研磨成粉末狀。采用真菌DNA提取試劑盒提取供試菌株DNA，引物：ITS1(5′-TCCGTAGGTGA ACCTGCGG-3′)和 ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGAT ATGC-3′)擴增產物由上海生工生物工程有限公司測序，測序結果在GenBank 中進行 BLAST 相似性比對，最后用MEGA 6.0的Neighbor-Joining構建系統發育樹。

1.2.4 培養條件優化的單因素實驗

1.2.4.1 種子液的培養

將篩選出的菌種接種至PDA液體培養基中，培養溫度為30 ℃、轉速為180 r/min，恒溫搖床培養18 h，作為發酵種子液備用。

1.2.4.2 固態發酵的初始條件

將油茶餅粕培養基進行滅菌處理后，接種10%的種子液，發酵溫度為30 ℃，發酵時間為72 h。

1.2.4.3 發酵時間選擇

在其他條件不變的情況下，設置發酵溫度為30 ℃，初始含水量為80%，設置不同的發酵時間分別為12、24、36、48、72、96、120 h，之后檢測茶皂素的降解率。期間每隔12 h搖瓶翻樣1次，每個處理重復3次。

1.2.4.4 發酵溫度選擇

在其他條件不變的情況下，選擇最優的發酵時間，其他條件與處理同1.2.4.3，設置發酵溫度為24、26、28、30、32、34、36 ℃。

1.2.4.5 初始含水量選擇

在其他條件不變的情況下，選擇最優的發酵時間和發酵溫度，其他條件與處理同1.2.4.3，設置初始含水量分別為為60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%。

1.2.4.6 初始加酸量選擇

在其他條件不變的情況下，選擇最優的發酵時間、發酵溫度和初始含水量，其他條件與處理同1.2.4.3，設置不同的初始加酸量分別為0.01 mol/L的HCl 2、4、6、8、10 mL。

1.2.5 黑曲霉降解油茶餅粕中茶皂素的條件響應面優化

在單因素實驗基礎上，采用Box-Bnhnken響應面法進行優化分析，設計溫度、時間和初始加酸量3個因素，每個因素取3個水平，以(-1,0,1)編碼，根據相應的實驗后，運用Design Expert 軟件對所得的數據進行二次回歸擬合后得到二次回歸方程，然后對各因素的主效應和交互效應進行分析，得到最優解，優化發酵條件并進行驗證，最終確定利用黑曲霉降解茶皂素的最優的發酵條件。

2 結果與分析

2.1 樣品的篩選結果

通過初篩得到6株目標菌種，經過復篩后得到目的菌株的降解率，目的菌種對油茶餅粕中的茶皂素的降解率如圖1所示，各菌株的降解率有較大的差異。

圖1 目的菌種對油茶餅粕中的茶皂素的降解率

本研究中的菌株來源于自然篩選，對于油茶餅粕中的茶皂素具有天然的降解優勢，黑曲霉L-2在自然條件下的降解率達到了60%以上，對比其他的菌種來說，菌種具有一定的優勢性；固態發酵相比于液態發酵在降解油茶餅粕中的茶皂素更具有優勢，推測可能的原因是黑曲霉L-2是絲狀真菌，在固態發酵中能夠使油茶餅粕起到蓬松多孔的狀態，增大了菌種接觸營養和氧氣的作用，液態發酵對于不溶于水的油茶餅粕的傳質傳氧有一定的限制作用。因此選取降解率最高的L-2作為后續實驗的菌種。

2.2 苗種的形態學和分子鑒定

菌株L-2的平板培養正面形態圖(左)和平板反面形態圖(右)如圖2所示。0 ℃恒溫培養L-2,培養初期，培養基表面長出質地疏松的較干燥的白色菌落，外觀形如絲狀小絨毛，與培養基的結合比較緊密。5 d后，表面開始出現黑色孢子，均勻分布在菌落中間成熟部分。菌株L-2 rDNA-ITS序列同源性系統發育樹如圖3所示，菌株L-2的rDNA-ITS序列與黑曲霉AspergillusnigerHQ305563.1相似性達到了99%，結合形態學特征鑒定為黑曲霉Aspergillusniger。

圖2 菌株L-2的平板培養正面形態圖(左)和平板反面形態圖(右)

圖3 菌株L-2 rDNA-ITS序列同源性系統發育樹

2.3 培養條件的優化

2.3.1 發酵時間對菌種降解茶皂素的影響

發酵時間對菌種降解茶皂素的影響如圖4所示。發酵前期，隨著時間的推移，降解率在逐步提高；96 h后，茶皂素的降解率趨于穩定，達到88.33%。在油茶餅粕發酵初期，由于黑曲霉可以產生一些活性酶，如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶以及纖維素酶等，可以利用其產生的酶對油茶餅粕中大分子的營養物質進行降解，有助于黑曲霉L-2的生長。發酵中期由于營養物質的消耗，茶皂素作為營養物質提供菌體生長的需要，因此發酵中期茶皂素的降解率在不斷的上升。發酵后期，油茶餅粕中的營養物質由于大量消耗，不足以為黑曲霉L-2的生長提供保障，茶皂素的降解率也趨于穩定的狀態。

圖4 發酵時間、發酵溫度、初始含水量以及初始加酸量對于茶皂素降解率的影響

2.3.2 發酵溫度對菌種降解茶皂素的影響

發酵溫度對菌種降解茶皂素的影響如圖4所示，隨著溫度的升高，茶皂素的降解率一直在升高，在32 ℃時，茶皂素的降解率達到了最大值86.12%。溫度高于32 ℃后，茶皂素的降解率下降的趨勢很明顯。溫度對于菌株降解茶皂素的影響比較顯著，因此選擇最佳的降皂溫度為32 ℃。

2.3.3 初始含水量對菌種降解茶皂素的影響

初始含水量對菌種降解茶皂素的影響如圖4所示，隨著含水量的不斷增加，茶皂素的降解率在不斷的升高，在含水量在80%的時候達到最大88.15%。在含水量超過80%以后，茶皂素的降解率持續降低。固態發酵中，氧傳遞對于菌體的生長有至關重要的作用。含水量在80%以下，油茶餅粕培養基呈現一種疏松、多孔的狀態，這對于氧氣的傳遞有一定的促進作用；而隨著含水量的升高，固體培養基越來呈現一種緊密的狀態，影響氧的傳遞。含水量太低也會導致菌體生長缺水分而不能大量的生長，進而影響茶皂素的降解。因此選擇80%的含水量作為最適含水量。

2.3.4 初始加酸量對菌種降解茶皂素的影響

初始加酸量對菌種降解茶皂素的影響如圖4所示，隨著加酸量的不斷增加，茶皂素的降解率在不斷的升高，在加酸量在4 mL的時候達到最大89.31%。在加酸量超過4 mL以后，茶皂素的降解率持續降低。霉菌的最適生長環境為酸性條件，因此，添加一定的酸可以促進黑曲霉的生長，同時可以抑制其他有害微生物的生長，提高了茶皂素的降解率。初始加酸量超過4 mL以后，降解率隨著酸的量的增加而降低，推測降解茶皂素的酶最適pH在加酸量4 mL附近，此時的pH=4.58。

2.3.5 響應面分析方案和實驗結果

單因素實驗分別從發酵時間、發酵溫度、初始加酸量和含水量分析了不同的因素對于黑曲霉L-2降解油茶餅粕中的茶皂素的影響，為了更加準確簡便地分析不同因素對降解茶皂素的交互影響，結合單因素實驗的結果進行分析，選取對結果影響較大的3個因素發酵溫度(A)發酵時間(B)初始加酸量(C)進行Box-Bnhnken實驗設計，以茶皂素的降解率(Y)為響應值在全局范圍內進行尋優，實驗設計及結果，Box-Behnken實驗因素與水平表見表1和Box-Behnken實驗設計與結果見表2。

表1 Box-Behnken實驗因素與水平表

表2 Box-Behnken實驗設計與結果

回歸模型方差分析見表3。應用Design-Expert 10.0.8軟件對表2和表3中的結果進行二次回歸分析，得到降解茶皂素的二次回歸方程模型。由表3可知，從各個因素的顯著性水平差異可知，對茶皂素的降解率的影響次序為B>A>C；二次項A2、B2、C2對茶皂素的降解率的影響都達到了極顯著水平(P<0.001)。模型P<0.000 1，表明回歸模型極顯著，其校正決定系數AdjR2=98.46%表明僅有總變異的1.54%不能由該模型進行解釋。相關系數R2=99.33%，表明該模型擬合程度較好，實驗誤差較小，失擬項不顯著，回歸方程可以較好地描繪各因素與響應值之間的真實關系。

表3 回歸模型方差分析

注：**為極顯著(P<0.01)，*為顯著(P<0.05)，R2=99.33%,AdjR2=98.46%。

所得的二次多項回歸擬合方程為：

茶皂素降解率=93.44-1.66A+2.678B+0.39C-1.69AB-0.63AC+1.32BC-6.45A2-5.07B2-3.09C2

根據方程得到的模型極值點取值為A=-0.177B=-0.313C=0.147，此時響應值Y的取值為最大值94.036%，即發酵溫度31.293 ℃，發酵時間103.507 h，初始加酸量4.574 mL，為方便操作，發酵時間取31.3 ℃，發酵時間取103.5 h，初始加酸量為4.57 mL。

2.3.6 驗證實驗

利用正交實驗所得到的數據進行培養基的配制，用響應面實驗的結果作為發酵條件，重復3組實驗進行茶皂素的降皂實驗，實際測得降解率為93.96%，與預測值接近，說明回歸模型真實可靠。

3 結論

單因素和響應面的分析結果表明：發酵溫度、發酵時間、初始加酸量3個主要因素對黑曲霉L-2降解油茶餅粕中茶皂素有顯著的影響，影響的大小為：發酵時間>發酵溫度>初始加酸量。黑曲霉降解油茶餅粕中茶皂素的最佳條件為發酵時間取31.3 ℃，發酵時間取103.5 h，初始加酸量為4.57 mL，此條件下可使黑曲霉L-2對于油茶餅粕種的茶皂素有最佳的降解率，達到93.96%。