酶解超聲波協同提取藜麥多糖及體外活性評價

李佳妮，白寶清，金曉第，范三紅

（山西大學生命科學學院，山西太原030006）

藜麥原產于南美洲安第斯山區的秘魯、玻利維亞等地，具有抗寒、抗旱、耐貧瘠和耐鹽堿等特征[1]，近些年才開始在全球其他地區得到推廣和種植，我國目前已經在西藏、山西靜樂、四川、青海等地實現規劃化種植[2]。藜麥是唯一含優質完全蛋白質的植物性食物[3]，富含不飽和脂肪酸、膳食纖維以及類黃酮、皂苷、葉酸等活性成分，并且礦物質含量豐富，明顯高于其他常見谷物[4]。藜麥不含麩質等過敏原[5]，且營養成分容易被吸收。除此之外，藜麥具有均衡營養[6]、抗氧化[7]、抗癌癥與減肥[8]等效果，適合于那些患有高血壓、高血糖[4]、高血脂等慢性病患者的輔助治療。藜麥具有很高的食用價值，是目前公認的適宜人類食用的“全營養食品”[9]。

多糖（polysaccharide）作為構成生命的四大基本物質之一，在自然界分布廣泛，是動植物的能源物質，也是構成動植物細胞壁的組成成分[10]。具有調節免疫、抗癌、抗氧化、輔助降血糖等功效[11]，所以多糖在保健食品、醫藥領域有廣泛的運用前景[12]。目前多糖提取常用的方法有：常規水提法、酸提取、超聲提取、微波提取、酶法等[13]，采用聯合方法提取的研究還比較少。袁俊杰等[14]采用水浴加熱回流法提取藜麥多糖，提取時間為1.5 h。徐瀾等[15]采用單一超聲輔助提取藜麥多糖，提取率為2 mg/g。由于酶具有用量少而催化效率高的特點，能夠加速多糖的溶出，克服傳統提取方法耗時長、產率低的缺陷。本試驗基于響應面法，采用超聲波與酶法聯合方法對藜麥多糖的提取工藝進行了研究，使多糖提取率提高，成本降低，從而為開發利用藜麥多糖提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮藜麥種子：山西華青藜麥產品開發有限公司；纖維素酶（酶活力為3.0×103U/g）、木瓜蛋白酶（酶活力為6 000 U/mg）：北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

JA1203N 型電子分析天平：梅特勒－托利儀器上海有限公司；101-2AB 型鼓風干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司；SB-5200DT 超聲波清洗機：寧波新芝生物科技股份有限公司；TDL-5 離心機：上海安亭科學儀器有限公司；SP-2000UV 型紫外可見分光光度計：上海光譜儀器廠；RE-52 旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 藜麥成分分析

1.3.1.1 藜麥中蛋白含量測定

采用凱氏定氮法測定藜麥中蛋白含量，參考GB 5009.5-2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》。

1.3.1.2 藜麥中粗脂肪含量測定

采用索氏抽提法測定藜麥中粗脂肪含量，參考GB 5009.6-2016《食品安全國家標準食品中脂肪的測定》。

1.3.1.3 藜麥中粗多糖含量測定

采用苯酚-硫酸法測定藜麥中粗多糖含量，參考SN/T 4260-2015《出口植物源食品中粗多糖的測定苯酚-硫酸法》。

1.3.2 藜麥多糖提取工藝

1.3.2.1 材料預處理

藜麥→挑選、去雜→粉碎→45 目過篩→80 ℃烘干→料液比1：10（g/mL）加入95%乙醇靜置6 h（除去脂類、低聚糖等小分子）→60 ℃烘干→密封，放入干燥器備用。

1.3.2.2 藜麥多糖提取

預處理后的藜麥→按料液比加水配成溶液→調節pH值→加酶，水浴恒溫提取1 h →煮沸滅酶10 min →超聲波輔助提取（240 W）→離心得上清液（4 000 r/min，15 min）→旋轉蒸發濃縮→加3 倍體積95 %乙醇→4 ℃靜置過夜→離心（4 000 r/min，15 min）→沉淀溶解定容→測定粗多糖濃度。

1.3.2.3 含量測定

采用苯酚-硫酸法[16]測定多糖含量，以葡萄糖為標準品，得標準曲線y=14.432x+0.017 9，R2=0.995 2。粗多糖溶解定容至100 mL，搖勻后吸取1 mL 稀釋至10 倍，于490 nm 波長處測其吸光度值，根據標準曲線計算藜麥多糖濃度。

藜麥多糖提取率Y/%=（C×V×N）/（32.4×W）×100

式中：W為藜麥粉末的質量，g；C為所測液多糖濃度，mg/mL；V為定容體積，mL；N為稀釋倍數；32.4 為本試驗藜麥多糖含量測定值，mg/g。

1.3.2.4 最佳輔助酶及其添加量確定

按1.3.2.2 方法，以不加酶做空白對照，分別添加纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和復合酶（纖維素酶：果膠酶：木瓜蛋白酶質量比為1：1：1），添加量均為原料質量的3 %，在最適溫度（50 ℃），最適pH值（蛋白酶6.8，其他5.0）下水浴恒溫提取1 h，比較不同輔助酶下多糖提取率。確定最佳輔助酶，設置添加量梯度，在最適條件下提取，確定最佳添加量。

1.3.2.5 單因素試驗

選取超聲時間（10、20、30、40、50 min），料液比[1：15、1：25、1：35、1：45、1：55（g/mL）]，超聲溫度（40、50、60、70、80 ℃）為自變量，以蒸餾水為溶劑，通過控制變量法對藜麥多糖提取條件進行單因素試驗，平行測定3 次。分別考察藜麥多糖提取率隨3 個單因素變化時的變化趨勢。

1.3.2.6 響應面試驗

基于單因素試驗，根據Box-Behnken 試驗設計原理，以超聲溫度、超聲時間及料液比為自變量，多糖提取率為響應值，試驗水平高低分別編碼-1、0、1，進行三因素三水平響應面試驗。響應面試驗數據經Design Expert 8.0 軟件分析，獲得提取藜麥多糖的最佳提取條件。試驗因素水平見表1。

表1 試驗設計因素水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.3.3 脫蛋白工藝

1.3.3.1 蛋白標準曲線繪制

以牛血清蛋白為標品，考馬斯亮藍法測定不同濃度牛血清蛋白的吸光度值，得蛋白標準曲線方程：y=0.143x-0.001，R2=0.993 9。

1.3.3.2 木瓜蛋白酶+Sevage 法脫蛋白

參考苗慧琴等[17]的方法，取適量提取的粗多糖，調節pH值至中性，加入原料質量2 %木瓜蛋白酶，在45 ℃條件下酶解1 h，煮沸滅酶10 min，冷卻至室溫后4 000 r/min 離心5 min，棄去變性蛋白層得上清液，加入1/3 體積Sevage 試劑（V氯仿：V正丁醇=4：1）劇烈振蕩30 min，4 000 r/min 離心15 min，棄去中間變性蛋白層和下層有機溶劑，取上層脫蛋白后的多糖液，重復多次，合并所有已完全脫蛋白的多糖液。

1.3.4 體外活性研究

1.3.4.1 對α-淀粉酶活力的抑制作用

參考GB/T 24401-2009《α-淀粉酶制劑》。

1.3.4.2 羥自由基清除能力測定

取不同梯度濃度的多糖溶液（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL）2 mL，加入6 mmol/L 硫酸亞鐵溶液2 mL，充分搖勻，靜置10 min，加入6 mmol/L 水楊酸溶液2 mL，搖勻并靜置30 min，于510 nm 處測定吸光度Ai，水楊酸溶液以蒸餾水代替測定本底Aj，多糖溶液以蒸餾水代替做空白A0。清除率S/%=[1-（Ai-A）j/A0]×100

1.3.4.3 DPPH 自由基清除率測定

配制0.2 mmol/L DPPH-無水乙醇溶液避光保存，取4 mL DPPH 溶液與2 mL 梯度濃度多糖溶液（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL）混合均勻，于25 ℃避光反應30 min，517 nm 波長下測定吸光度Ax，以乙醇溶液代替DPPH 自由基測得背景對照Ay，再以蒸餾水代替多糖溶液測得空白對照A0，計算清除率。

1.3.4.4 ABTS+自由基清除率測定

取25 mL 的7 mmol/L ABTS 溶液和440 μL 的140 mmol/L過硫酸鉀混合，在室溫、避光條件下靜置12 h～16 h，配制成ABTS＋自由基儲備液[18]。使用時用無水乙醇稀釋成工作液，使其在734 nm 波長下的吸光度為0.7±0.02，記為Ar。取0.1 mL 梯度濃度多糖提取液（1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mg/mL），加入ABTS+自由基工作液5 mL，混均，室溫下避光反應10 min，測定734 nm波長處吸光度，記為At。空白以無水乙醇代替ABTS+自由基工作液測吸光度值，記為A0。

2 結果分析

2.1 藜麥主要成分分析結果

藜麥主要成分見表2。

表2 藜麥主要化學成分分析Table 2 Analysis of main chemical constituents of Chenopodium quinoa

2.2 藜麥多糖提取結果分析

2.2.1 最佳輔助酶確定

不同輔助酶下多糖提取率見圖1。

圖1 不同輔助酶下多糖提取率對比Fig.1 The comparison of polysaccharide yields under different assisted enzymes

添加適量的輔助酶對藜麥多糖提取率有明顯提高，纖維素酶和果膠酶使藜麥細胞壁遭到破壞，有助于細胞內的多糖溶出，提高提取率。藜麥中蛋白質含量較高，有的多糖與蛋白質結合在一起，難以提取或干擾測定[19]，蛋白酶的加入使得蛋白質酶解，有效解除蛋白質干擾，提高提取率。圖1可直觀地看出，纖維素酶對于提高藜麥多糖提取率效果最為明顯，與不加酶相比，提取率增加到原來的2.5 倍。本試驗選取纖維素酶作為添加酶。

2.2.2 最佳輔助酶添加量

不同纖維素酶添加量下多糖提取率如圖2。

圖2 藜麥多糖提取率隨纖維素酶添加量的變化情況Fig.2 The changing situation of the yield of Chenopodium quinoa changed with the amount of cellulase added

在底物濃度一定的情況下，酶促反應速度正比于酶濃度。因此隨著酶初始濃度的增大，酶促反應也加快。但隨著酶初始濃度繼續增大，酶促反應速度并沒有因此加快，甚至受到抑制。其原因是：當酶已經達到飽和狀態時，過量的酶聚集在有限的底物上，反而降低了酶的利用率。圖2可直觀地看出纖維素酶最佳添加量為3%。

2.2.3 單因素試驗結果

不同超聲溫度、超聲時間及料液比下多糖提取率見圖3。

圖3 超聲溫度、超聲時間和料液比對藜麥多糖提取率的影響Fig.3 Effects of ultrasonic temperature，ultrasonic time and solidliquid ratio on the extraction rate of Chenopodium quinoa polysaccharide

圖3a 表明，多糖提取率隨超聲溫度的而逐漸升高上升，60 ℃左右達到最高，隨后又逐漸下降。這是由于升溫能夠促進多糖溶解，并且提高傳質速度。但隨著溫度的繼續升高，高溫破壞多糖的結構，反而降低了多糖的浸出率。圖3b可觀察出，多糖提取率隨超聲時間延長先升高再下降，在20 min 左右時達到最大。分析原因可能是在一定的變化區間內，隨著超聲時間延續，會促進藜麥多糖的溶解，然而隨著超聲時間繼續延續，多糖的結構遭到破壞，再綜合考慮縮短工時，20 min 為最佳提取時間。圖3c可直觀地得出，多糖提取率隨溶劑用量的增加先逐漸升高后逐漸降低，料液比為1：35（g/mL）左右達到最大。分析可能原因是隨著提取溶劑用量的增加，多糖能夠充分溶解，隨著提取溶劑用量繼續增加，反而降低了提取液中可溶性多糖的含量，從而提取率降低。綜上，藜麥多糖提取的最佳料液比是1 ∶35（g/mL）。

2.2.4 響應面試驗結果

2.2.4.1 Box-Behnken 試驗設計及結果

基于單因素試驗，綜合考慮經濟效益，確定各個自變量最佳區間范圍，依據Box-Behnken 試驗的設計理論，優化藜麥多糖提取工藝，試驗設計和結果如表3。

2.2.4.2 模型的建立與顯著性檢驗

經Design Expert 8.0 分析，以藜麥多糖提取率作為響應值，對Box-Behnken 試驗設計結果進行分析，得到響應面回歸方程如下：

從方程中可得出各變量對響應值交互作用的影響程度依次是：A超聲溫度＞B超聲時間＞C料液比。表4是回歸模型的方差分析結果。

表3 Box-Behnken 試驗設計及結果Table 3 Box-Behnken design with experimental and predicted results for response surface methodology

表4 回歸模型的方差分析結果Table 4 Results of variance analysis of regression model

從整體上看，模型P值小于0.000 1，表明回歸模型顯著性極好；失擬項P值為0.900 2，不顯著，表明模型與現實情況模擬程度極好[20]；調整復相關指數R2=說明多糖提取率的變化98.37%都來自于超聲溫度與超聲時間以及料液比[21]，即試驗的誤差小，預測值與實際值間符合情況較好。F值體現各變量對響應值的貢獻率，F值越大則自變量對藜麥多糖提取率的影響越大，分析結果與回歸方程一致，其中提取率受超聲溫度的影響遠超過其他因素的影響。綜上分析，此方案可以用來優化藜麥多糖的提取工藝條件。

從表4分析得出，單因素中，超聲溫度和超聲時間對多糖提取率影響極顯著，料液比對多糖提取率作用不顯著。在兩個因素交互影響中，超聲溫度和超聲時間的交互作用對多糖提取率影響不明顯，而超聲溫度和料液比、超聲時間和料液比的交互作用對多糖提取率影響顯著。

2.2.4.3 響應面分析

圖4～圖6 為兩因素交互作用對多糖提取率的等高線圖和響應面曲圖。

圖4 超聲溫度和超聲時間Fig.4 Ultrasound temperature and extraction time

圖5 超聲溫度和液料比Fig.5 Ultrasound temperature and solid-liquid ratio

圖6 超聲時間和液料比Fig.6 Ultrasound time and solid-liquid ratio

等高線圖、響應面圖可以直觀地反映兩因素間的交互作用。響應面圖越陡說明兩自變量的交互作用對響應值影響程度越大，相反，越平緩交互作用影響越不顯著。等高線圖越偏離圓形交互影響越強，反之，越接近圓形交互影響越弱。分析以上3 組圖得出，超聲溫度和料液比間交互作用對藜麥多糖提取率作用最為明顯，其次是超聲時間和料液比間的交互作用，而超聲溫度和超聲時間的交互影響最不顯著。

從響應面圖觀察得出，超聲溫度60 ℃～65 ℃之間、超聲時間15 min～20 min 之間時多糖提取率有最大值。對比圖5 與圖6 得出，藜麥多糖提取率受超聲溫度的影響比超聲時間大；比較圖4和圖5可以得出多糖提取率受超聲時間作用比料液比大；同樣，對比圖4和6可得料液比對藜麥多糖提取率的作用較超聲溫度小，與方差分析結果一致。響應面圖開口向下，多糖提取率隨各自量的升高，不斷上升，中心點過后又不斷下降，本試驗模型具有駐點，且駐點正是最大的值。各響應面變圖頂點對應最優提取量。

2.2.4.4 最佳工藝條件驗證

為進一步確定最優點，應用響應面分析方法對模型進行回歸分析，得到提取藜麥多糖的最佳提取參數是：超聲溫度64.90 ℃；超聲時間18.34 min；料液比1：32.5（g/mL），此時多糖提取率為70.78%。考慮到實際操作的方便，將理論值調整為：超聲溫度65 ℃；超聲時間18 min；料液比1：33（g/mL）。在此基礎上平行驗證3 次，測得藜麥多糖平均提取率為68.08%。與理論值相接近，說明通過響應面優化后的回歸模型能夠預測實際提取率。

2.3 脫蛋白試驗結果

每次脫蛋白的蛋白脫除率及多糖保留率見圖7。

圖7 酶法+Sevage 法的脫蛋白效果Fig.7 Effect of enzymatic assisted sevage on deproteination

多糖液經木瓜蛋白酶酶解后，蛋白質脫除率可達28.25%，同時多糖保留了96.52%。再用Sevage 試劑處理4 次，可以脫除79.85%的蛋白質，且多糖損失較少，達到較好的脫蛋白效果。

2.4 體外活性研究結果

2.4.1 對α-淀粉酶活力抑制作用

不同多糖濃度下α-淀粉酶活力的抑制率見圖8。

圖8可以看出藜麥多糖對α-淀粉酶活力的抑制率與其濃度有一定的劑量依賴[22]，隨著多糖濃度的增加，抑制率也顯著提高，在多糖濃度1 mg/mL 左右達到最高抑制率，隨著多糖濃度的繼續增加，在抑制效果相近的情況下，過量的多糖反而降低了其利用率，抑制率也降低。

圖8 梯度濃度藜麥多糖對α-淀粉酶活力的抑制作用Fig.8 The inhibitory effect of Chenopodium quinoa polysaccharide on the activity of alpha-amylase

2.4.2 DPPH 自由基清除率

不同多糖濃度下DPPH 自由基清除率見圖9。

圖9 DPPH 自由基清除效果隨藜麥多糖濃度的變化情況Fig.9 The scavenging effect of different concentration Chenopodium quinoa polysaccharides on DPPH free radicals

由圖9可觀察出，藜麥粗多糖對DPPH 自由基有一定的清除效果，其清除能力遠低于Vc，隨其濃度的增加，清除率緩慢上升。當多糖提取液濃度為3 mg/mL時，DPPH 自由基清除率可達28.81%。

2.4.3 羥自由基清除率

不同多糖濃度下羥自由基清除率見圖10。

圖10 羥自由基清除效果隨藜麥多糖濃度的變化情況Fig.10 Effect of different concentrations of Chenopodium quinoa polysaccharides on hydroxyl radical scavenging

羥自由基一般存活時間較短，反應活性較高。圖10可以直觀地看出羥自由基清除率隨多糖濃度的增加有著明顯的升高，且藜麥多糖對羥自由基清除效果顯著，在濃度為3 mg/mL 時清除率可達72.1%。

2.4.4 ABTS+自由基清除率

不同多糖濃度下ABTS+自由基清除率見圖11。

圖11 ABTS+自由基清除效果隨藜麥多糖濃度的變化情況Fig.11 Effect of different concentration Chenopodium quinoa polysaccharides on the scavenging of ABTS+free radical

ABTS 在氧化劑作用下生成綠色的ABTS+自由基，當抗氧化物存在時ABTS+自由基的產生會被抑制。從圖11可以看出，藜麥粗多糖對ABTS+自由基清除效果較為一般，且隨劑量的增加效果變化不明顯，在濃度為6 mg/mL 時清除效果最佳，可清除ABTS+自由基18.1%。

3 結論

纖維素酶能夠酶解藜麥細胞壁，加速多糖溶出，同時具有量少而催化效率高的特點，能夠有效降低生產成本。液體中傳播的超聲波產生空化作用，使得細胞破碎，細胞內溶物更好地溶出。但是采用此法的同時，也可能使多糖降解，應該在多糖提取率顯著提高的條件下，盡可能縮短超聲時間，降低超聲溫度來減少超聲波的機械剪切作用對多糖造成的損壞。酶法輔助超聲波提取法可以明顯提高藜麥多糖的提取率，通過對比試驗表明，經酶法輔助超聲波提取比單一采用超聲波提取，多糖提取率增加1.5 倍。

尋求可替代的天然無毒的抗氧化劑是當前食品領域研究的熱點，就藜麥多糖而言，對不同自由基清除率差異較大，其中對羥自由基清除效果最為顯著。此外，藜麥多糖對α-淀粉酶活力具有一定的抑制作用，能有效地阻礙碳水化合物水解，試驗結果為開發藜麥資源提供參考，為進一步開拓糖尿病人食品提供理論依據。