腎透明細胞癌進展樞紐基因的WGCNA篩選

[摘要]目的 通過加權基因共表達網絡分析（WGCNA）識別腎透明細胞癌發生及進展過程中的樞紐基因。方法從基因表達綜合數據庫下載GSE73731數據，通過WGCNA篩選樞紐基因，分析樞紐基因的表達水平及其與腫瘤分級、分期、預后的關系，使用GEPIA數據庫和UALCAN數據庫進行驗證，并對樞紐模塊基因進行GO和KEGG富集分析。結果通過構建共表達網絡，確定green模塊（包括355個基因）為樞紐模塊，進一步篩選得到CEP55、CCNB1、NUF2、BUB1B、KIF14共5個樞紐基因。各樞紐基因與腎透明細胞癌組織學分級密切相關（t=17.53～25.18，Plt;0.01），且BUB1B基因對低級別與高級別腎透明細胞癌具有較高的診斷價值（AUC=0.706，Plt;0.01）。GEPIA和UALCAN數據庫驗證結果顯示，各樞紐基因與腫瘤的分級及分期相關，且CEP55、BUB1B高表達與腫瘤的總生存期及無病生存期較差明顯相關。基因功能富集分析結果顯示，樞紐模塊基因主要富集在細胞周期生物學過程及通路上。結論 本研究通過構建基因共表達網絡篩選出5個樞紐基因，這5個基因與腫瘤的分期分級及預后密切相關;樞紐基因可能通過細胞周期相關通路來影響腎透明細胞癌的發生、進展及預后。

[關鍵詞]癌，腎細胞;寡核苷酸序列分析;數據挖掘;樞紐基因

[中圖分類號]R737.11[文獻標志碼]A[文章編號]2096-5532（2019）04-0392-07

[ABSTRACT]ObjectiveTo identify the hub genes associated with the development and progression of clear cell renal cell carcinoma （ccRCC） using weighted gene co-expression network analysis （WGCNA）. MethodsThe dataset GSE73731 was downloaded from Gene Expression Omnibus database. Besides， the hub genes were identified using WGCNA. The correlations between the expression levels of the hub genes and tumor grade， stage， and prognosis were analyzed， and then were validated using GEPIA and UALCAN databases. Moreover， gene ontology （GO） and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） enrichment analyses were performed for the genes in hub module. ResultsThrough constructing the co-expression network， green module （involving 355 genes） was identified as the hub module. Afterwards， five hub genes （CEP55， CCNB1， NUF2， BUB1B， and KIF14） were further screened out. All the hub genes showed close correlations with the histological grade of ccRCC （t=17.53-25.18，Plt;0.01）， and BUB1B exhibited high diagnostic values for low-grade and high-grade ccRCCs （AUC=0.706，Plt;0.01）. The validation results of GEPIA and UALCAN databases showed that all the hub genes were associated with tumor grade and stage， and increased CEP55 and BUB1B were significantly related to poor overall survival and disease-free survival. Enrichment analysis showed that the genes in green module were mainly involved in the biological processes and pathways related to cell cycle. ConclusionFive hub genes were identified by WGCNA， which were associated with tumor grade， stage， and prognosis. These hub genes might affect the development， progression， and prognosis of ccRCC through cell cycle-associated pathways.

[KEY WORDS]carcinoma， renal cell; oligonucleotide array sequence analysis; data mining; hub genes

腎細胞癌（RCC）是泌尿系統常見腫瘤，在男性腫瘤中居第9位，在女性腫瘤中居第14位。2018年，RCC占全球新發腫瘤病例的2.2%，死亡率為1.8%，其中80%～90%為腎透明細胞癌（ccRCC）[1-2]。

盡管癌癥的檢測和治療取得了很大進展，但ccRCC的總生存率仍然很低。超過1/3的病人在診斷時已經發生轉移，Ⅳ期ccRCC的5年標準化相對生存率僅為6%，而Ⅰ期約為84%[3-4]。因此，研究ccRCC的發生發展機制，尋找新的生物標志物對ccRCC的早期診斷、治療及預后判斷具有重要意義。傳統的“單疾病單基因”的研究模式不能從多基因協同角度了解疾病的發生與發展。本研究采用生物信息學的方法，通過加權基因共表達網絡分析（WGCNA），將功能相似的基因歸入同一基因模塊，探究基因之間的相關性以及基因模塊和臨床特征之間的關聯，篩選樞紐基因，以了解ccRCC發生進展過程中的關鍵基因及信號通路，為ccRCC治療尋找新的靶點。

1材料與方法

1.1差異表達基因的篩選

從NCBI的GEO數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載編號GSE73731的ccRCC芯片數據集。該數據集基于GLP570平臺，包括265例ccRCC組織，其中包括高分化（Furhman Ⅰ/Ⅱ）病例112例，中/低分化病例144例（Furhman Ⅲ/Ⅳ），未分級者9例。Ⅰ期病人41例，Ⅱ期病人12例，Ⅲ期病人28例，Ⅳ期病人44例，分析數據缺失140例。利用R軟件中Bioconductor（http：//www.bioconductor.org）內的Affy包[5]讀取原始文件，使用RMA算法預處理得到標準化的基因表達譜數據。剔除離群樣本，用R軟件的limma包[6]對基因表達矩陣進行分析，設置校正后P值（FDR）lt;0.05和對數化表達變化倍數（|log2FC|）gt;2.0作為篩選表達差異基因的閾值，得到高分化與中/低分化ccRCC組織間的差異表達基因（DEGs），并繪制熱圖及火山圖。

1.2基因共表達網絡構建

使用R軟件的WGCNA包[7]，通過方差分析篩選方差前25%的基因用于WGCNA。計算各基因間的Pearson相關系數，選擇適當的軟閾值β使得構建的網絡更符合無標度網絡的標準。采用一步法構建基因網絡，將鄰接矩陣轉化為拓撲重疊矩陣TOM，利用層次聚類產生一個基因的層次聚類樹。計算基因顯著性（GS）以及模塊顯著性（MS），用以衡量基因與臨床信息的顯著性，并分析模塊及模型的顯著關聯。

1.3樞紐基因的篩選

計算各基因模塊身份（MM）以衡量基因在模塊中的重要性。設置參數為|MM|gt;0.9和|GS|gt;0.2篩選基因。將樞紐模塊中的基因上傳至STRING數據庫（https：//string-db.org/）構建蛋白相互作用網絡，選取點度中心性（degree）gt;80篩選基因，兩者取交集即為樞紐基因。

1.4樞紐基因的表達與ccRCC分級、分期及預后的關系

使用GSE73731數據對樞紐基因進行線性回歸分析，探究基因表達量與ccRCC分級之間的關系，并繪制受試者工作特征（ROC）曲線，計算曲線下面積（AUC），當AUCgt;0.7時，認為該基因對診斷ccRCC進展具有較高的靈敏度和特異度。使用基于TCGA的GEPIA數據庫（http：//gepia.cancer-pku.cn/）和UALCAN數據庫（http：//ualcan.path.uab.edu/）分析樞紐基因在 ccRCC中的表達水平及其與腫瘤分級、分期、預后的關系。

1.5GO和KEGG富集分析

使用DAVID數據庫（http：//david.abcc.ncifcrf.gov/）對特定模塊的基因進行GO和KEGG通路分析，以錯誤發現率（FDR）lt;0.05為差異具有統計學意義。

2結果

2.1差異表達基因篩選

使用R軟件讀取及預處理芯片數據后，共得到20 460個表達譜基因。以FDRlt;0.05和|log2FC|gt;5.0為閾值篩選后，得到 333個DEGs，其中上調基因152個，下調基因181個。DEGs熱圖及火山圖見圖1。

2.2基因共表達網絡構建

本研究通過方差分析篩選方差前25%的基因共5 115個用于WGCNA。以相關系數等于0.9作為標準，使用pickSoftThreshold函數，選擇鄰接矩陣權重參數（軟閾值）β=6構建基因模塊。使用一步法構建共表達矩陣，并利用動態混合剪切法，得到12個基因模塊，其中green模塊（包括355個基因）的GS高于其他模塊（圖2）。

因此，green模塊與ccRCC病理分級的相關性最高，與腫瘤進展明顯相關。

2.3樞紐基因的篩選

對green模塊基因以|MM|gt;0.9和|GS|gt;0.2為參數篩選樞紐基因得到10個樞紐基因，將green模塊基因上傳至STRING數據庫以degreegt;80為參數篩選樞紐基因得到23個樞紐基因，兩者取交集得到CEP55、CCNB1、NUF2、BUB1B、KIF14共5個在共表達網絡和蛋白相互作用網絡皆重要的樞紐基因（表1）。

2.4樞紐基因的表達與ccRCC分級、分期及預后的關系

使用GSE73731數據集進行線性回歸分析，結果顯示各樞紐基因與ccRCC組織學分級呈正相關（t=17.53～25.18，Plt;0.01）。見圖3A～E。ROC曲線分析，BUB1B基因對ccRCC組織學分級具有較高診斷效能（AUC=0.706，Plt;0.01），而CEP55、CCNB1、NUF2、KIF14對ccRCC組織學分級診斷效能較弱（AUC=0.680～0.691，Plt;0.01）。見圖3F～J。基于TCGA的UALCAN和GEPIA數據庫驗證結果顯示，5個樞紐基因的表達水平在腫瘤組織中均明顯升高（FC=1.76～7.13，Plt;0.01），且與腫瘤的分級及分期明顯相關。見圖4。預后結果顯示，CEP55、NUF2、BUB1B與腫瘤的總生存期（OS）明顯相關（HR=1.5～1.9，Plt;0.01）。見圖5A～E。CEP55、CCNB1、BUB1B、KIF14與腫瘤的無病生存期（DFS）明顯相關（HR=1.6～1.7，Plt;0.01）。見圖5F～J。

2.5GO和KEGG富集分析

為了了解樞紐模塊的可能功能，對green模塊中的基因進行了GO和KEGG富集分析。GO富集分析顯示，模塊基因主要富集在細胞周期、細胞器分裂、核分裂等生物學過程;KEGG富集分析顯示，模塊基因主要富集在細胞周期通路上。見圖6。

3討論

本研究利用生物信息學方法，通過對ccRCC芯片數據集GSE73731進行分析，篩選得到表達上調基因152個，表達下調基因181個。通過WGCNA，將表達模式相似的基因進行聚類，并分析模塊與特定性狀或表型之間關聯。結果顯示，green模塊與ccRCC病理分級的相關性最高，green模塊內基因集與腫瘤的進展與預后密切相關。為進一步篩選在ccRCC進展過程中的關鍵基因，將green模塊中進一步篩選出的基因與蛋白相互作用網絡篩選出的基因交集，篩選出CEP55、CCNB1、NUF2、BUB1B、KIF14共5個樞紐基因。對GSE73731數據集進行線性回歸分析，結果顯示各樞紐基因與ccRCC組織學分級密切相關，且BUB1B基因具有較高的診斷價值，說明其能夠區分不同病理分級的ccRCC。使用TCGA數據進行獨立的外部驗證，各樞紐基因的表達水平在腫瘤組織中均明顯升高，且與腫瘤的分級及分期明顯相關，說明其在ccRCC發生及進展過程中起關鍵作用。本文預后結果顯示，CEP55、BUB1B基因與腫瘤的OS及DFS明顯相關，提示CEP55和BUB1B基因對ccRCC病人的預后具有一定的預測價值。

CEP55基因編碼一種中心體相關蛋白，在中間體依賴性的細胞功能如中心體復制、細胞周期及胞質分裂的調節中發揮重要作用[8]。有研究表明，在肝細胞肝癌、肺腺癌、卵巢癌、結腸癌、乳癌等腫瘤中，CEP55高表達與腫瘤的高惡性程度、高侵襲性以及不良預后相關[9-10]。CCNB1編碼細胞周期蛋白B1，是細胞周期G2/M期的重要調控因子，在非小細胞肺癌、外陰鱗狀細胞癌、結直腸癌中對腫瘤病人的抗藥性、局部或遠處轉移、復發、生存等指標具有良好的預測價值[11-13]。細胞分裂相關基因NUF2編碼的蛋白，作為NDC80復合體的重要組成部分之一，在動粒-微管黏附中扮演重要角色，在有絲分裂和腫瘤發生發展中起著重要作用[14-16]。BUB1B為紡錘體檢測點蛋白，作為有絲分裂檢測點的重要功能蛋白，調節細胞周期及有絲分裂。BUB1B在腎癌及乳癌等多種腫瘤中過表達，且其突變及過表達與染色體不穩定性、細胞分化和衰老相關，可促進腫瘤的發生及進展[17-18]。KIF4作為驅動蛋白超家族中的成員，可調節紡錘體的形成、染色體的分離和胞質分裂，其表達異常可引起染色體分離失敗和胞質分裂不完全，從而引起細胞異常、增殖和分化，誘發腫瘤形成，其異常表達已經在多種惡性腫瘤中得到證實[19-21]。

本研究對樞紐模塊基因進行GO和KEGG富集分析，結果顯示，模塊基因主要富集在細胞周期等相關生物學過程及通路上。在真核生物中，細胞周期主要受細胞周期蛋白（Cyclin）、細胞周期蛋白依賴激酶（CDK）以及細胞周期蛋白依賴激酶抑制劑（CKI）所構成的Cyclin-CDK-CKI信號網絡精準調節。具有明顯周期性表達的Cyclin可以與不同的CDK結合成復合物，并激活CDK的激酶活性，從而在不同時相對細胞周期進行調控。而CKI對CDK具有抑制作用。Cyclin-CDK-CKI信號網絡對細胞周期的調控主要通過Rb途徑和p53途徑。在Rb途徑中，生長因子與細胞表面受體如fos/jun/myc結合，可促進Cyclin表達并形成Cyclin-CDK復合物，磷酸化Rb蛋白后，Rb-E2F復合物釋放E2F進入細胞核，促進下游DNA表達。而CKI可以抑制Cyclin-CDK活性，使得Rb去磷酸化，阻滯細胞周期進展。在p53通路中，DNA受損后，p53可結合到p21基因啟動子區，激活p21轉錄。P21作為重要的CKI，可抑制CDK活性，可阻滯細胞從G1期進入S期[11-12，22]。

CCNB1是細胞周期中G2/M轉換的關鍵因子，可進入細胞核內，與CDK1結合形成CCNB1-CDK1復合物，通過Rb途徑誘導細胞進入M期。當細胞退出M期時，CCNB1降解，CDK1激酶活性喪失，細胞進入下一周期[22]。一項針對骨肉瘤的研究表明，CEP55的表達水平與CCND1呈正相關，敲低CEP55表達導致CCND1表達水平降低。CCND1可與CDK4/CDK6形成復合物，調控G1期到S期的轉換[23-24]。一項針對肝細胞肝癌的研究表明，敲低NUF2表達可導致CCNB1、Cdc25A、Cdc2等蛋白表達水平降低，誘導細胞周期停滯在G0/G1期，說明NUF2也可以通過Rb通路調控細胞周期[25]。一項針對多發性骨髓瘤的研究表明，BUB1B可通過介導CDC20/CCNB軸促進細胞增殖，在腫瘤進展中起重要作用[26]。有研究表明，KIF14敲低可下調Skp2和Cks1的表達，進而抑制蛋白酶體依賴性p27Kip1泛素化，p27Kip1的增加抑制細胞周期蛋白的表達，包括CCNB1、CCND1和CCNE1，從而抑制腫瘤發生及進展[25，27-28]。因此，CEP55、CCNB1、NUF2、BUB1B、KIF14等5個樞紐基因可能通過細胞周期相關通路，尤其是Rb通路，來影響ccRCC的發生、進展及預后。

綜上所述，本研究通過構建基因共表達網絡，篩選出與ccRCC進展相關的5個樞紐基因，這5個基因與腫瘤的分期、分級及預后密切相關;樞紐基因可能通過細胞周期相關通路來影響ccRCC的發生、進展及預后[1]。

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（本文編輯 馬偉平）