miR-92a對宮頸癌細胞增殖凋亡影響及其機制

[摘要]目的 探討miR-92a對宮頸癌細胞增殖凋亡的影響及其機制。方法應用逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測宮頸癌細胞系中miR-92a的表達情況。將細胞分為空白對照組（未轉染）、miR-92a抑制物陰性對照組（轉染miR-92a inhibitor NC）和miR-92a抑制物組（轉染miR-92a inhibitor），并以RT-PCR檢測轉染效果，采用MTT法檢測細胞增殖，流式細胞儀檢測細胞凋亡，Western blot檢測細胞中基質金屬蛋白酶2（MMP-2）和生存素（Survivin）蛋白的表達。結果 與正常上皮293T細胞相比，miR-92a在宮頸癌Hela、C33A和Caski細胞中的表達水平均明顯升高（t=6.446～14.544，Plt;0.001），其中以Hela細胞上升最為顯著。與空白對照組比較，轉染miR-92a inhibitor使Hela細胞中miR-92a的表達、A值、MMP-2和Survivin蛋白表達均顯著下降，細胞凋亡率顯著升高（t=3.479～22.18，Plt;0.05）;而轉染miR-92a inhibitor NC后差異無顯著性（Pgt;0.05）。結論 miR-92a在宮頸癌細胞中高表達，干擾其表達可以抑制細胞生長，其作用機制可能與下調MMP-2和Survivin蛋白表達有關。

[關鍵詞]宮頸腫瘤;微RNAs;細胞增殖;細胞凋亡;基質金屬蛋白酶2;凋亡調節蛋白質類

[中圖分類號]R737.33;R342.2[文獻標志碼]A[文章編號] 2096-5532（2019）04-0406-05

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the effect of miR-92a on the proliferation and apoptosis of cervical cancer cells and its mechanism. MethodsReverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR） was used to measure the expression of miR-92a in cervical cancer cell line. Cells untransfected， transfected with miR-92a inhibitor negative control， and transfected with miR-92a inhibitor were assigned to blank control group， miR-92a inhibitor negative control group， and miR-92a inhibitor group， respectively， and the transfection effect was evaluated by RT-PCR. MTT assay was used to evaluate cell proliferation， and flow cytometry was used to detect cell apoptosis. Western blot was used to measure the protein expression of matrix metalloproteinase （MMP）-2 and survivin in the cells. ResultsCompared with normal epithelial 293T cells， the Hela， C33A， and Caski cells of cervical cancer had significant increases in the expression level of miR-92a （t=6.446-14.544，Plt;0.001）， and the Hela cells had the greatest increase. Compared with the blank control group， the miR-92a inhibitor group had significant reductions in the expression of miR-92a， A value， MMP-2， and survivin protein in Hela cells， and a significant increase in cell apoptosis rate （t=3.479-22.18，Plt;0.05）; however， there were no significant differences in the above indices between the miR-92a inhibitor negative control group and the blank control group （Pgt;0.05）. ConclusionmiR-92a is highly expressed in cervical cancer cells， and interfering with its expression can inhibit cell growth， possibly by down-regulating the expression of MMP-2 and survivin protein.

[KEY WORDS]uterine cervical neoplasms; microRNAs; cell proliferation; apoptosis; matrix metalloproteinase 2; apoptosis regulatory proteins

2015年數據顯示，全球宮頸癌的新發病例和死亡數分別為52.76萬和26.57萬，而發展中國家是其高發區，且近年來有年輕化的趨勢[1]。MiR-92a作為微小核糖核酸（miRNAs）中的一員，與血管內皮細胞的形成密切相關[2]，且在胃癌、結直腸癌和肝細胞癌等多種腫瘤中高表達，與腫瘤細胞增殖和凋亡等生理過程密切相關[3-5]。有研究指出miR-92a在宮頸癌病人血清中的表達明顯升高，且參與宮頸癌的增殖和侵襲[6-7]，但其在宮頸癌中的作用及其機制尚不完全明確。故本研究采用RNA干擾其表達，旨在進一步闡明miR-92a對宮頸癌細胞增殖凋亡的影響及可能的分子機制。

1材料與方法

1.1細胞和試劑

正常上皮293T細胞和宮頸癌Hela、C33A、Caski細胞均來自中國科學院生物化學與細胞生物學研究所細胞庫。引物、miR-92a inhibitor和miR-92a inhibitor NC購于上海吉瑪制藥技術有限公司，生存素（Survivin）抗體、β肌動蛋白（β-actin）抗體、基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）和辣根過氧化物酶標記的IgG（HRP-IgG）二抗均購自美國Santa Cruz公司;蛋白提取試劑盒、反轉錄試劑盒、二喹啉甲酸（BCA）蛋白檢測試劑盒、膜聯蛋白V-FITC（Anne-xin V-FITC）/碘化丙啶（PI）凋亡試劑盒和ECL發光試劑盒均購自上海碧云天公司，Trizol試劑和噻唑藍（MTT）試劑購自大連Takara公司，胎牛血清、DMEM培養基、胰蛋白酶和Lipofectamine 2000均購自美國Sigma公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養取出保存的293T、Hela、C33A和Caski細胞株，于37 ℃的水浴鍋中解凍。解凍后，將其轉移至含有2 mL DMEM完全培養液的4個離心管中，離心棄培養液，加入DMEM培養液懸浮細胞。將4種細胞分別轉移至4個培養瓶中，補充培養液后置于含體積分數0.05 CO2、37 ℃、飽和濕度為95%的培養箱中培養。將4種細胞以適當的密度分別接種到含有體積分數0.10胎牛血清的DMEM培養液中，于培養箱內常規培養，待細胞融合度為70%時，加2.5 g/L胰蛋白酶消化，以1∶2比例進行傳代。

1.2.2miR-92a表達檢測收集上述4種細胞，用Trizol法提取總RNA，并以紫外線分光光度計檢測其濃度，逆轉錄獲取cDNA。逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）反應條件：94 ℃預變性4 min;94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共32個循環;反應體系為25 μL，其中正反引物各2 μL。以U6作內參，采用2-△△CT法計算miR-92a的表達水平。每個樣品重復3次。所用引物及其序列見表1。

1.2.3細胞分組及轉染取對數生長期的Hela細胞，以每孔2 mL（2×108/L）接種至96孔板上，將其分為空白對照組（A組）、miR-92a抑制物陰性對照組（B組）和miR-92a抑制物組（C組）。其中A組細胞不進行轉染（只加入等量培養液稀釋的Lipfectamine 2000），B和C組細胞分別轉染miR-92a inhibitor NC和miR-92a inhibitor，按照Lipfecta-mine 2000脂質體轉染試劑盒說明書操作。轉染6 h后，更換培養液，繼續培養48 h后收集細胞，以1.2.2中的方法檢測轉染效果。

1.2.4細胞增殖檢測收集上述轉染后48 h的各組Hela細胞，調整細胞密度后以每孔3×104個接種至培養板上，每組設5個復孔，在含體積分數0.05 CO2、37 ℃、飽和濕度為95%的培養箱中常規培養。48、72和96 h后收集細胞，加入5 g/L的MTT溶液20 μL，37 ℃下反應4 h后，棄上清，加200 μL二甲基亞砜，充分反應后，使用酶標儀（480 nm波長）檢測各組細胞的吸光度（A）。重復3次。

1.2.5細胞凋亡檢測分別取轉染后48 h的各組Hela細胞，經胰酶消化及PBS洗滌后，以結合緩沖液重懸細胞，參照凋亡試劑盒說明書的步驟檢測各組細胞的凋亡率。重復3次。

1.2.6MMP-2和Survivin蛋白表達檢測取1.2.3中轉染后48 h的各組Hela細胞，加入細胞裂解液提取總蛋白，BCA法檢測其濃度。取50 μg蛋白樣品上樣到120 g/L的聚丙烯酰胺凝膠中電泳，結束后轉至聚偏二氟乙烯膜上。以封閉液封閉2 h后，加入1∶800稀釋的MMP-2抗體、Survivin抗體和β-actin抗體，于4 ℃下孵育過夜，再加入1∶1 000稀釋的二抗，37 ℃下處理1 h后，ECL顯色，以β-actin為內參，計算MMP-2和Survivin蛋白的相對表達量。重復3次。

1.3統計學分析

用SPSS 20.0軟件進行統計學分析，計量資料數據以[AKx-D]±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2結果

2.1miR-92a在宮頸癌細胞中的表達

RT-PCR結果表明，與正常上皮293T細胞中miR-92a相對表達量（1.05±0.06）相比，miR-92a在宮頸癌Hela（3.78±0.35）、C33A（2.69±0.18）和Caski（2.26±0.23）細胞中的表達水平均明顯升高（t=6.446～14.544，Plt;0.001），其中以Hela細胞上升最為顯著（F=72.327，Plt;0.001）。

2.2miR-92a對Hela細胞增殖的影響

RT-PCR檢測結果表明，轉染miR-92a inhibitor使miR-92a的表達水平（0.18±0.02）較對照組（0.99±0.06）下降了18.18%，差異有統計學意義（t=22.18，Plt;0.001）;而miR-92a抑制物陰性對照組（0.95±0.05）與空白對照組間miR-92a的表達差異無統計學意義（Pgt;0.05）。提示抑制Hela細胞中miR-92a的表達是有效的。MTT法檢測各組細胞的A值表明，與空白對照組相比，miR-92a抑制物組細胞的A值隨時間的延長均顯著降低（t=3.781～5.668，Plt;0.05），但miR-92a抑制物陰性對照組的A值變化不顯著（t=0.191～0.510，Pgt;0.05）。提示抑制miR-92a表達可明顯抑制Hela細胞的增殖（F=8.420～20.705，Plt;0.05）。見表2。

2.3miR-92a對Hela細胞凋亡的影響

流式細胞儀檢測結果表明，與空白對照組的細胞凋亡率（6.22±1.03）%相比，轉染miR-92a inhibitor的細胞凋亡率（16.35±2.42）%顯著升高（t=7.766，Plt;0.05），而轉染miR-92a inhibitor NC的細胞凋亡率（7.11±0.86）%上升不明顯（t=0.682，Pgt;0.05）。提示抑制miR-92a表達可誘導Hela細胞凋亡。見圖1。

2.4miR-92a對MMP-2和Survivin蛋白表達影響

Western blot檢測結果表明，MMP-2和Survivin在miR-92a抑制物組細胞中的表達較空白對照組均顯著降低，差異具有統計學意義（t=3.479～4.877，Plt;0.05），而MMP-2和Survivin在miR-92a抑制物陰性對照組中的表達與空白對照組間的差異無統計學意義（t=0.316～0.610，Pgt;0.05）。提示抑制miR-92a表達可以下調Hela細胞中MMP-2和Survivin蛋白的表達。見圖2、表3。

3討論

MiR-92a家族在血管形成、器官發育和腫瘤的進展方面具有重要調控作用，成熟的miR-92a基因是由miR-92a～1和miR-92a～2生成，位于13q13染色體上[8-10]。大量研究顯示，miR-92a參與甲狀腺乳頭狀癌、膀胱癌和子宮內膜癌等多種腫瘤的發生發展[11-13]。SHARIFI等[14]發現，抑制miR-92a表達可通過調控p63誘導白血病細胞凋亡并抑制細胞增殖。仲飛等[15]研究發現，miR-92a反義寡核苷酸可抑制胃癌細胞增殖并促進細胞凋亡。XIAO等[16]和趙靚等[17]在鼻咽癌及骨肉瘤的研究中發現，抑制miR-92a的表達可調控PTEN/Akt信號通路抑制癌細胞的增殖，并促進細胞凋亡。有研究發現，miR-92a在宮頸癌中高表達，但其在宮頸癌發生發展中的作用研究較少[6-7]。本研究RT-PCR檢測結果表明，miR-92a在宮頸癌Hela、C33A和Caski細胞中的表達水平均明顯升高，其中以Hela細胞上升最為顯著。脂質體干擾Hela細胞中miR-92a的表達后，可明顯抑制細胞增殖并促進細胞凋亡。提示miR-92a可能在宮頸癌中發揮著癌基因的作用。

基質金屬蛋白酶（MMPs）可通過調控細胞周期參與成神經管細胞瘤細胞的增殖過程[18]，也可以通過信號途徑參與肺腺癌細胞凋亡[19]。MMP-2是MMPs成員之一，可通過降解Ⅳ型膠原蛋白、調節細胞間的黏附和促進新生血管形成等參與腫瘤細胞的增殖、侵襲和凋亡等過程[20-22]，干擾MMP-2表達可下調VEGF和上調Cleaved Caspase-8蛋白表達，抑制前列腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移，并促進細胞凋亡[23]。Survivin是最強的凋亡抑制因子，通過調控半胱氨酸天冬酶和微管蛋白等參與細胞凋亡及細胞的有絲分裂，在細胞周期、細胞增殖、凋亡和血管形成等過程中發揮著重要的作用[24-25]。MMP-2和Survivin在宮頸癌中的陽性表達率均顯著高于正常宮頸組織，且與腫瘤的浸潤深度及惡性程度密切相關[26]。LIN等[27]在miR-92a促進肺癌細胞侵襲的研究中發現，anti-miR-92a能夠降低MMP-2活性。牛巍巍等[28]研究指出，miR-92a抑制物可通過下調Survivin和Bcl-2蛋白的表達促進胃癌細胞凋亡。為了探討miR-92a抑制宮頸癌發生發展的分子機制，本研究采用Western blot進一步檢測Hela細胞中MMP-2和Survivin蛋白的表達情況。結果顯示，Hela細胞中MMP-2和Survivin蛋白的表達水平均顯著下降，提示抑制miR-92a可能通過下調MMP-2和Survivin表達抑制細胞增殖、侵襲并促進細胞凋亡。

綜上所述，miR-92a在宮頸癌細胞中高表達，干擾其表達可抑制細胞增殖并促進凋亡，其作用機制可能為下調MMP-2和Survivin表達。

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（本文編輯于國藝）