他汀類藥物對食管癌細胞增殖及Akt蛋白表達影響

[摘要] 目的 探討他汀類藥物對食管癌細胞增殖及蛋白激酶B（Akt）蛋白表達影響。方法 取食管鱗癌（ESCC）細胞株進行培養，以不同時間（24、48 h）和不同濃度（15、45 μmol/L）的普伐他汀、辛伐他汀進行干預（4個實驗組），并設立空白對照組。分別檢測各組細胞增殖和丙二醛（MDA）含量，以及辛伐他汀對細胞周期和細胞凋亡、Akt mRNA表達的影響。結果 普伐他汀、15 μmol/L辛伐他汀干預癌細胞時，對細胞增殖均無明顯影響（Pgt;0.05），45 μmol/L辛伐他汀能夠顯著抑制癌細胞增殖（F=5.345、16.383，Plt;0.05）。各濃度普伐他汀干預癌細胞時，MDA含量均無明顯變化（Pgt;0.05）;各濃度辛伐他汀干預癌細胞時，MDA含量均有明顯上升（F=5.913、7.435，Plt;0.05）。辛伐他汀干預癌細胞時，G0/G1期細胞實驗組明顯高于對照組，S期、G2/M期細胞實驗組明顯低于對照組（t=2.975～10.027，Plt;0.05）。各濃度辛伐他汀干預癌細胞時，Akt mRNA表達均明顯下降（F=6.541、7.548，Plt;0.05）。結論 辛伐他汀對食管癌細胞確有抑制細胞增殖、促進細胞凋亡的作用，并能夠抑制Akt蛋白的表達。

[關鍵詞] 食管腫瘤;普伐他丁;細胞增殖;細胞凋亡;癌基因蛋白質v-Akt

[中圖分類號] R735.1;R972.6 "[文獻標志碼] A "[文章編號] "2096-5532（2019）04-0434-04

[ABSTRACT] Objective To investigate the effect of statins on the proliferation of esophageal cancer cells and the expression of protein kinase B （Akt）. "Methods An esophageal squamous cell carcinoma （ESCC） cell line was cultured， and the cells were divided into 4 experimental groups and were treated with pravastatin or simvastatin at different concentrations （15 and 45 μmol/L）. A blank control group was also set up. Cell proliferation and malondialdehyde （MDA） level were measured for all groups， and the effect of simvastatin on cell cycle， cell apoptosis， and mRNA expression of Akt was analyzed. "Results Pravastatin and 15 μmol/L simvastatin had no significant effect on the proliferation of ESCC cells （Pgt;0.05）， and 45 μmol/L simvastatin significantly in-hibited the proliferation of cancer cells （F=5.345 and 16.383，Plt;0.05）. The cancer cells treated with different concentrations of pravastatin had no significant change in MDA content （Pgt;0.05）， while those treated with different concentrations of simvastatin had a significant increase in MDA content （F=5.913 and 7.435，Plt;0.05）. When the cancer cells were treated with simvastatin， compared with the control group， the experimental group had a significantly higher number of cells in the G0/G1 phase and a signi-ficantly lower number of cells in the S phase or G2/M phase （t=2.975-10.027，Plt;0.05）. The cancer cells treated with different concentrations of simvastatin had a significant reduction in the mRNA expression of Akt （F=6.541 and 7.548，Plt;0.05）. "Conclusion Simvastatin can inhibit the proliferation and promote the apoptosis of esophageal cancer cells and inhibit the expression of Akt protein.

[KEY WORDS] esophageal neoplasms; pravastatin; cell proliferation; apoptosis; oncogene protein v-Akt

食管癌是常見的消化道腫瘤，每年全球約有30萬人死于此病[1]。近年有多項研究表明，他汀類藥物在抑制包括肺癌、肝癌、乳癌等多種腫瘤細胞生長方面有效而且安全，可使癌癥風險率降低20%～30%，但對于食管癌方面的研究則少見報道[2-4]。因此，本文采用體外細胞實驗的方式，培養食管鱗癌（ESCC）細胞株并采用他汀類藥物進行干預，取其親水型代表普伐他汀和親脂型代表辛伐他汀做對照研究，探討他汀類藥物對食管癌細胞增殖及蛋白激酶B （Akt）蛋白表達影響。現將結果報告如下。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

人類ESCC細胞株DC875（上海澤葉生物科技有限公司，來源庫：ATCC）;辛伐他汀（CAS 79902-63-9，上海士鋒生物科技有限公司）;普伐他汀（CAS 81131-70-6，上海譜振生物科技有限公司）。CCK-8試劑及試劑盒（同仁化學研究所，日本）;FACS Calibur流式細胞儀（Becton Dickinson，USA）;丙二醛 （MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所）;逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑和試劑盒（北京諾博萊德科技有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 EAC細胞株和ESCC細胞株常規培養于RPMI 1640培養基中，取對數生長期細胞進行實驗檢測。

1.2.2 細胞增殖實驗 將對數生長期的細胞樣本根據干預時間設立24、48 h干預培養板。各板樣本再根據采用普伐他汀、辛伐他汀干預分為兩組，每組內設15、45 μmol/L兩種濃度，包括15 μmol/L普伐他汀組（B組）、45 μmol/L普伐他汀組（C組）、15 μmol/L辛伐他汀組（D組）、45 μmol/L辛伐他汀（E組），同時設空白對照組（對照組，A組），每組含兩個復孔。采用CCK-8試劑盒檢測細胞增殖。實驗重復5次，統計增殖平均值。

1.2.3 MDA檢測 按照MDA試劑盒的使用說明進行操作，記錄吸光度值。同時，采用BCA蛋白濃度測試試劑盒（碧云天生物技術研究所）測定樣本蛋白濃度。

1.2.4 細胞周期和細胞凋亡檢測 采集45 μmol/L濃度辛伐他汀處理的細胞樣本液，使用FACS Calibur流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡率。

1.2.5 Akt mRNA檢測 取對照組及45 μmol/L辛伐他汀藥物處理24、48 h的細胞樣本液，采用熒光定量PCR對Akt基因進行擴增。

1.3 評價指標

本研究評價的指標包括：①細胞增殖吸光度變化;②MDA含量[5-6]; ③細胞周期各期的占比以及凋亡率;④Akt mRNA含量。

1.4 統計學分析

采用SPSS 17.0統計學軟件進行統計學分析。采用2×2×2析因設計的方差分析，比較不同他汀類藥物濃度和作用時間對細胞增殖的影響及交互作用;采用2×2析因設計方差分析，比較他汀類藥物對MDA含量的影響，以及辛伐他汀對Akt mRNA含量的影響及交互作用;采用兩獨立樣本t檢驗，比較辛伐他汀對細胞周期及凋亡率的影響。檢驗水準α=0.05。

2 結 "果

2.1 他汀類藥物對細胞增殖的影響

與空白對照組相比較，在15 μmol/L普伐他汀和辛伐他汀、45 μmol/L普伐他汀干預癌細胞時，均對細胞增殖無明顯影響（Pgt;0.05）;而辛伐他汀在45 μmol/L濃度時，能夠顯著抑制癌細胞增殖（F=5.345、16.383，Plt;0.05）。析因設計的方差分析顯示，不同藥物有交互作用（F藥物=9.435，P<0.05），不同濃度有交互作用（F濃度=6.674，P<0.05），不同時間有交互作用（F時間=4.687，P<0.05），濃度與時間沒有交互作用（P>0.05）。見表1。

2.2 他汀類藥物對MDA含量的影響

A～E組MDA含量分別為1.73±0.16、1.75±0.21、1.74±0.18、2.63±0.36、7.61±1.15。與空白對照組相比，各濃度普伐他汀干預癌細胞時，MDA含量均無明顯變化（Pgt;0.05）;各濃度辛伐他汀干預癌細胞時，MDA含量均有明顯上升（F=5.913、7.435，Plt;0.05）。析因設計的方差分析顯示，不同藥物有交互作用（F藥物=4.687，P<0.05），不同濃度有交互作用（F濃度=7.635，P<0.05），濃度與時間沒有交互作用（P>0.05）。

2.3 辛伐他汀對細胞周期及凋亡率的影響

與對照組相比，45 μmol/L辛伐他汀干預癌細胞時，G0/G1期實驗組明顯高于對照組，S期、G2/M期實驗組明顯低于對照組（t=2.975～10.027，Plt;0.05）。實驗組細胞凋亡率明顯高于對照組（t=14.278，Plt;0.05）。見表2。

2.4 辛伐他汀對Akt mRNA表達的影響

15 μmol/L辛伐他汀干預24、48 h細胞的Akt mRNA含量分別為74.32±8.21、63.47±7.13，45 μmol/L辛伐他汀干預24、48 h分別為60.15±7.43、27.43±2.98。各濃度辛伐他汀在干預癌細胞不同時間時，Akt mRNA含量均有明顯下降（F=6.541、7.548，Plt;0.05）。析因設計的方差分析顯示，不同時間有交互作用（F時間=5.617，P<0.05），不同濃度有交互作用（F濃度=5.617，P<0.05），濃度與時間有交互作用（F時間╳濃度=1.056，P<0.05）。

3 討 "論

他汀類藥物屬于HMG-CoA還原酶抑制劑，除了能夠強效地降低總膽固醇和低密度脂蛋白（LDL）"以外，還能夠在一定程度上提升高密度脂蛋白的水平[7-9]。國內有研究顯示，他汀類藥物對白血病細胞有誘導凋亡的作用，可以降低腫瘤細胞轉移和侵襲的能力，其機制可能與Akt蛋白信號通路有關[10]。Akt是一種絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，為PI3K通路的下游信號分子，而PI3K通路在體內負責多種細胞的增殖代謝，其可以抵抗細胞凋亡，在癌細胞的增殖中起重要作用[11-13]。本文選取他汀類藥物親水型代表普伐他汀和親脂型代表辛伐他汀作為干預藥物，觀察其對于ESCC細胞株的增殖和凋亡的影響并探討其機制。

本文研究結果顯示，辛伐他汀只有在高濃度下（45 μmol/L）對于細胞增殖的抑制較為明顯。這提示我們辛伐他汀對于食管癌細胞的增殖抑制存在濃度依賴性，而親水型的普伐他汀對細胞增殖則無明顯的抑制作用[14-17]。一項關于癌細胞的體外培養研究顯示，親脂型的辛伐他汀在一定濃度基礎上可發揮對腫瘤細胞的抑制作用，而普伐他汀則無明顯影響[18]。其機制可能與其通過細胞膜的方式有關，親水性的藥物分子更難透過磷脂雙分子層到達細胞核[19-21]。但與臨床試驗不同，細胞實驗并不能完全模擬人體通過正常代謝途徑后對藥物滲透性產生的額外作用。因此，尚不能斷言親水型的普伐他汀對于人體的食管癌細胞的增殖無作用[22]。另外，本文結合文獻分析，親水型的他汀類藥物不能發揮作用可能與食管癌細胞表面缺乏相應的有機陰離子轉運縮氨酸（OATP1B1）通道有關，后期通過進一步檢測食管癌細胞上的OATP1B1通道分布情況，該檢測可以作為證明親水型他汀類藥物不能發揮相應作用的可靠方法[24]。

由于對細胞代謝的分子難以逐個分析，故本文選取MDA作為細胞氧化損傷的代表指標[23-25]，檢測其細胞生物學功能。結果表明，各濃度辛伐他汀干預癌細胞時，MDA含量均有明顯上升。提示辛伐他汀干預后癌細胞出現了過氧化損傷，且呈濃度依賴性。結合之前細胞增殖的結果，可以認為普伐他汀并未真正進入細胞內部發揮作用[26]。同時，推測過氧化殺傷是抑制細胞增殖的機制之一。本文辛伐他汀干預對細胞周期影響的結果顯示，ESCC細胞阻滯于G0/G1期，與國外的研究結果相符[27]。

Akt蛋白通路在腫瘤細胞的增殖凋亡方面起到重要作用。對于一些研究顯示他汀類藥物可調節通路Akt蛋白的表達[28]，本文也進行了論證。結果表明，不同濃度和不同時間辛伐他汀干預癌細胞時Akt mRNA含量均明顯下降，且呈濃度依賴性。顯示了他汀類藥物在抑制腫瘤細胞增殖、誘導其凋亡方面的新研究方向。然而，關于他汀類藥物的副作用以及對于食管癌預后是否存在負面影響，則需要進一步的臨床研究證實。

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（本文編輯 于國藝）