miR-26a在糖尿病腎病大鼠腎臟的表達及其意義

[摘要] 目的 探討microRNA-26a（miR-26a）在糖尿病腎病（DN）中的表達及其與DN的關系。方法 高脂高糖喂養聯合腹腔注射小劑量鏈脲霉素構建大鼠2型糖尿病模型（T2DM），另設正常對照（NC）組。于動物模型建立后8周收集兩組大鼠血、尿及腎臟標本。比較兩組血、尿生化指標，蘇木精-伊紅染色觀察腎小球病理變化，實時定量PCR方法檢測腎臟miR-26a、Nephrin mRNA表達水平，Western Blot方法測定腎臟Nephrin蛋白表達水平。結果 與NC組比較，T2DM組大鼠空腹血糖（FBG）、膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、內生肌酐清除率（Ccr）、24 h尿蛋白定量均明顯升高（t=10.710～28.421，Plt;0.05）。光鏡下觀察，T2DM組腎小球體積較NC組增大，基底膜增厚，系膜區擴大，腎小球毛細血管腔受壓變窄。與NC組比較，T2DM組Nephrin mRNA和miR-26a表達明顯減少（t=9.070、12.270，Plt;0.05），Nephrin蛋白表達明顯減少（t=7.429，Plt;0.05）。Pearson分析顯示，miR-26a與Nephrin表達正相關（r=0.650，Plt;0.01）。結論 miR-26a 在DN大鼠腎組織表達降低，并與大鼠DN足細胞的損傷密切相關。

[關鍵詞] 糖尿病腎病;足細胞;miR-26a;大鼠

[中圖分類號] R587.24 "[文獻標志碼] A "[文章編號] "2096-5532（2019）04-0447-05

[ABSTRACT] Objective To investigate the expression of microRNA-26a （miR-26a） in diabetic nephropathy （DN） and its relationship with DN. "Methods A rat model of type 2 diabetes mellitus （T2DM） was established by high-fat and high-sugar diet combined with intraperitoneal injection of low-dose streptozotocin， and a normal control （NC） group was also established. Blood， urine， and kidney specimens were collected at 8 weeks after the establishment of the animal model. The blood and urine biochemical parameters were compared between the two groups. Glomerular pathology was observed by HE staining. The expression of miR-26a and Nephrin mRNA was determined by qPCR， while the protein expression of Nephrin in the renal cortex was measured by Western blot. "Results Compared with the NC group， the T2DM group had significantly increased fasting blood glucose， cholesterol， triglyceride， endogenous creatinine clearance， and 24 h urinary protein excretion （t=10.710-28.421，Plt;0.05）. As observed under light microscopy， the T2DM group had a larger glomerular volume， a thicker basement membrane， an enlarged mesangial region， and a smaller glomerular capillary lumen compared with the NC group. Meanwhile， the T2DM group had significant reductions in the expression of Nephrin mRNA and miR-26a （t=9.070，12.27;Plt;0.05）， as well as Nephrin protein （t=7.429，Plt;0.05）， as compared with the NC group. Pearson analysis showed that miR-26a was positively correlated with the expression of Nephrin （r=0.650，Plt;0.01）. "Conclusion In rats with DN， the expression of miR-26a in renal tissue is reduced， which is closely associated with the damage of podocytes.

[KEY WORDS] diabetic nephropathies; podocytes; miR-26a; rats

糖尿病腎病（DN）是糖尿病（DM）最嚴重和常見的慢性并發癥之一，研究顯示其為導致終末期腎病（ESRD）的最常見病因[1-2]。因此，防治DN、延緩腎功能的減退，越來越受到醫學界關注。足細胞、腎小球毛細血管內皮細胞與腎小球基底膜共同構成腎小球濾過屏障，足細胞在腎小球濾過功能中發揮著重要作用。足細胞病變是DN發病機制的中心環節及影響DN病人預后的主要因素之一[3-4]。高葡萄糖干預足細胞、鈣離子內流增加誘發足細胞凋亡[5]。Nephrin與podocin等分子共同參與裂孔隔膜信號轉導[6]。檢測Nephrin的表達可以評估DN足細胞病理損傷[7]。近期有研究結果顯示，microRNA-26a（miR-26a）在狼瘡腎炎及IgA腎病病人腎小球足細胞中表達顯著降低[8]。miRNA是高度保守的小非編碼RNA家族，可以通過降解或抑制翻譯下調靶蛋白的表達[9-10]。然而，目前miR-26a與DN足細胞病變的關系國內外研究甚少。本課題通過構建2型糖尿病（T2DM）模型研究miR-26a在DN中的表達水平，探討miR-26a與DN的關系，為DN防治提供依據。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 DN大鼠模型的制備及分

清潔級SD雄性大鼠30只，體質量為180～220 g（青島大學附屬醫院動物實驗室提供），SPF級環境飼養，環境溫度為（22±2）℃、相對濕度45%～65%，每日光照12 h。隨機分為正常對照組（NC組，n=10）和T2DM組（n=20）。NC組常規飼料喂養;T2DM組給予高脂高糖飲食（Research Diet公司，USA，每100 g飼料含：常規飼料66.5 g，蔗糖20.0 g，豬油10.0 g，膽固醇2.5 g，膽酸鹽1.0 g）喂養8周后，聯合小劑量鏈脲佐菌素（30 mg/kg，Sigma，USA）一次性腹腔注射1周后，于禁食不禁水12 h后鼠尾靜脈取血，測定空腹血糖（FBG）及空腹胰島素（FINS），并計算胰島素敏感指數（ISI）。以FBG≥NC組大鼠FBG均值+3個標準差（血糖≥10.0 mmol/L）及ISI≤NC組大鼠的均值為T2DM模型建立成功[11-12]。

1.2 血液和尿液生化指標檢測

T2DM造模成功后，繼續高脂喂養8周，用代謝籠收集大鼠24 h尿液以測定清蛋白和肌酐，測鼠尾收縮壓（SBP）并采集大鼠尾靜脈血。參照相關文獻方法[11]，檢測大鼠血標本FBG、膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）、血肌酐（Scr），尿液標本尿肌酐（Ucr）、24 h尿蛋白定量。根據Ucr、Scr計算內生肌酐清除率（Ccr）[13]。Ccr=Ucr/Scr×24 h尿量。用ELISA檢測試劑盒（Novus公司，美國）檢測FINS，按說明書方法操作，用酶標儀檢測450 nm波長處吸光度。

1.3 大鼠腎臟組織病理檢查

處死大鼠，取部分腎皮質用40 g/L多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋，4 μm切片，蘇木精-伊紅（HE）染色后光鏡下觀察腎組織病理學變化。

1.4 實時定量PCR檢測Nephrin mRNA表達

采用TRIZOL試劑（TaKaRa公司，日本）提取腎皮質總RNA，通過紫外線分光光度計檢測RNA的濃度和純度。應用RNA反轉錄逆轉錄試劑盒（TaKaRa公司，日本）合成cDNA。以GAPDH作為內參照，應用實時熒光定量PCR儀（美國ABI 7500）進行PCR擴增，引物由TaKaRa公司合成，引物的序列見表1。實時定量PCR反應條件為：95 ℃、10 min，95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，擴增45個循環。用2-△△CT計算相對表達量，△△CT=（CT實驗組目的-CT實驗組內參）-（CT對照組目的-CT對照組內參）。每個實驗組均重復檢測3次。

裂解腎皮質，用BCA試劑盒測定蛋白濃度，蛋白煮沸變性。取30 μg總蛋白，行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，室溫下以5 g/L脫脂奶粉封閉1 h，加一抗搖勻后置于4 ℃冰箱內孵育過夜。一抗Nephrin（1∶1 000，美國Novus），一抗GAPDH（1∶2 000，英國Abcam）。TBST洗膜3×12 min后加入二抗（1∶10 000，中國Elabscience）室溫搖床孵育1 h。電化學發光液（ECL）顯色并掃描結果。所有實驗均進行3次。用Image J軟件分析實驗條帶。

1.6 統計學分析

應用SPSS 22.0軟件進行統計學分析，符合正態分布的計量資料結果用±s表示，兩組數據比較用t檢驗;相關性分析用Pearson分析。Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結 "果

2.1 兩組大鼠一般情況比較

本文14只大鼠T2DM造模成功，造模成功率70%。T2DM組大鼠的FBG、TC、TG、SBP、LDL、Ccr、24 h尿蛋白定量較NC組明顯升高，ISI、HDL顯著低于NC組，差異有統計學意義（t=5.387～28.421，Plt;0.05）;而兩組間Scr差異則無統計學意義（Pgt;0.05）。見表2。

2.2 兩組腎臟組織病理比較

NC組大鼠腎小球結構完整、清晰，并無明顯異常。

4期張巖，等. miR-26a在糖尿病腎病大鼠腎臟的表達及其意義449

與NC組比較，T2DM組大鼠腎小球體積增大，基底膜增厚，系膜區擴大，腎小球毛細血管腔受壓變窄。

2.3 兩組Nephrin mRNA及miR-26a表達比較

與NC組相比較，T2DM組Nephrin mRNA、miR-26a表達量減少（t=12.270、9.070，Plt;0.05），見表3。Pearson分析表明，miR-26a與Nephrin表達正相關（r=0.65，Plt;0.01）。

2.4 兩組Nephrin蛋白表達比較

與NC組比較，T2DM組Nephrin蛋白表達量減少（t=7.429，Plt;0.05）。見圖1、表3。

3 討 "論

DN為1型和2型DM的嚴重并發癥之一[14]，最終可發展為ESRD[1，15]。目前關于DN發病機制尚不明確。足細胞是附著在腎小球基底膜外側的終末分化的上皮細胞，是腎小球濾過屏障的重要組成部分[16]。高糖通過刺激NADPH氧化酶和線粒體途徑增加細胞內活性氧的產生，刺激鈣調磷酸酶TRPC6激活，促使凋亡基因的活化導致足細胞凋亡，并且是導致小鼠1型DM和T2DM的早期病理機制[17]。DKD大鼠模型腎臟足細胞鈣調磷酸酶激活和活性氧增多可刺激TRPC6誘導的足細胞凋亡[18]，而抑制TRPC6可降低NFAT mRNA改善高葡萄糖誘導的足細胞損傷，保護腎小球濾過屏障完整性[19]。有研究表明，雷公藤多甙通過上調自噬和下調β-arrestin-1改善足細胞損傷，延緩小鼠DN發生[20]。國外有研究證實，足細胞凋亡是DN發病機制中的中心環節[3-4]。

Nephrin與podocin等分子共同參與足細胞裂孔隔膜信號轉導[5]。Nephrin的表達變化可以用來評估大鼠DN病變及足細胞的損傷[7]。本文實驗結果顯示，T2DM組的造模成功率為70%，T2DM組FBG、TC、TG、SBP、LDL、24 h尿蛋白定量較NC組大鼠均明顯升高，伴胰島素抵抗;與NC組比較，T2DM組腎臟組織出現病理改變，Nephrin基因和蛋白表達降低，提示DN腎臟組織病理損傷。有研究顯示，miR-26a在自身免疫性腎小球腎炎小鼠以及IgA腎病病人腎小球足細胞中表達顯著降低[8]，并且與非DN相關的腎小球足細胞損傷密切相關。miRNA是高度保守小非編碼RNA家族，miRNA與靶mRNA的3′非翻譯區（3′UTR）配對結合從而負向調節靶基因的表達，可通過降解或抑制翻譯下調靶蛋白[9-10]。國內外研究結果證實，miRNA參與多種腎臟疾病的發生發展，miR-23b在1型DM組及T2DM組外周血及腎臟組織中的表達下降[21];miR-146a在急性腎損傷組織的表達水平降低[22]。在人和小鼠腎臟組織miR-26a呈高水平特異性表達[23]，足細胞是小鼠腎臟中miR-26a表達的主要位點。目前國內外關于miR-26a與DN病變關系的研究甚少。本文研究結果表明，T2DM組miR-26a表達降低，并且miR-26a與Nephrin表達正相關，提示miR-26a表達降低與大鼠DN病變及足細胞的損傷密切相關。ICHII等[8]的研究顯示，miR-26a在小鼠自身免疫性腎小球腎炎中表達降低并與足細胞的損傷緊密相關，本文結果與其相一致。另有研究結果表明，miR-217通過靶向調節TNFSF11改變人足細胞的凋亡，是膜性腎病一種有用的診斷生物標志物[24]。尿miR-30c-5p和miR-192-5p為缺血再灌注誘導的腎損傷的潛在生物標志物[25]。尿miR-377和miR-216a也是DN風險的生物標志物[26]。

因此推測miR-26a可能對DN診斷有一定價值，但需進一步研究證明。

綜上所述，miR-26a在DN大鼠腎組織表達降低，并與大鼠DN病變及足細胞的損傷密切相關。目前，國外已有學者研究miR-26a在狼瘡型腎小管間質炎癥、腎衰竭、免疫性腎病等疾病表達變化及作用機制[8，24]。本實驗研究miR-26a與DN足細胞損傷的關系，在國內外研究甚少。本課題后續將進一步深入研究miR-26a在DN足細胞損傷中的作用機制，為DN的治療提供依據。

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（本文編輯 黃建鄉）