萃取濃縮沼液對(duì)尖孢鐮刀菌和腐皮鐮孢菌抑制效果的影響研究

劉繼紅， 尹 芳， 王昌梅， 趙興玲， 吳 凱， 柳 靜， 楊 紅， 劉士清， 張無(wú)敵

(云南師范大學(xué)， 云南 昆明 650500)

三七(Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen)是一種人參屬雙子葉被子植物[1]，喜生長(zhǎng)于溫暖、避光、陰濕的環(huán)境[2,3]。三七主要成分與人參相似，包括氨基酸、糖類(lèi)、皂苷、揮發(fā)油、黃銅、微量元素等[4]，從而決定三七具有廣泛的藥用價(jià)值[5]，是一種馳名中外的名貴藥材。但目前因三七獨(dú)特的生長(zhǎng)環(huán)境和栽培方式，其復(fù)種年限增長(zhǎng)且無(wú)明顯效果，再加上三七農(nóng)的不合理施肥和用藥。導(dǎo)致栽培三七的土壤中各種土傳病菌繁殖和流行，尤其是三七根腐病，造成三七連作障礙加劇，嚴(yán)重影響了三七植株的正常生長(zhǎng)[6,7]。經(jīng)研究鑒定顯示，尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)和腐皮鐮孢菌(Fusariumsolani)就是導(dǎo)致三七根腐病的主要病原菌[8]。

沼氣是有機(jī)物質(zhì)秸稈、雜草、人畜糞便、垃圾、污泥等，在厭氧條件下，多種微生物對(duì)其進(jìn)行分解厭氧代謝的產(chǎn)物。沼液中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、礦物質(zhì)、水解酶、B族維生素、氨基酸、植物激素、抗生素和腐殖酸等，是一種很好的有機(jī)液肥，和生物農(nóng)藥[9-10]。另外許多研究顯示，沼液對(duì)多種植物病原菌都有很好的抑制效果。但目前還未出現(xiàn)將沼液應(yīng)用到防治三七根腐病病原菌的相關(guān)案例。

目前防治三七根腐病的措施有很多，包括農(nóng)業(yè)防治、生物防治、化學(xué)防治等[7]，雖然這些措施在防治三七根腐病上具有各自的優(yōu)勢(shì)，但是依然不具有持久、有效的防治效果。鑒于目前還沒(méi)有用沼液來(lái)防治三七根腐病病原菌的相關(guān)研究，為了探究沼液中活性物質(zhì)對(duì)尖孢鐮刀菌和腐皮鐮孢菌的抑制效果，本實(shí)驗(yàn)采用6種不同極性的有機(jī)溶劑(乙酸乙酯、苯、乙醚、甲苯、環(huán)己烷、石油醚)對(duì)沼液去除80%水分以后的濃縮液進(jìn)行萃取再濃縮，旨在于探究出能否萃取濃縮出對(duì)尖孢鐮刀菌和腐皮鐮孢菌有抑制效果的物質(zhì)，從而增強(qiáng)沼液抵抗尖孢鐮刀菌和腐皮鐮刀菌的能力。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 供試病原菌

實(shí)驗(yàn)所用尖孢鐮刀菌和腐皮鐮孢菌由云南師范大學(xué)能環(huán)學(xué)院農(nóng)村能源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(該室分離提純并鑒定的菌株)所提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

實(shí)驗(yàn)室采用常規(guī)的PDA培養(yǎng)基[11]。采用馬鈴薯為培養(yǎng)基，配方為：馬鈴薯200 g(去皮切成1 cm 左右的正方體小塊后煮30 min，過(guò)濾取清液用)，葡萄糖25 g，瓊脂13 g，加水至1000 mL，不調(diào)節(jié)pH值。

1.1.3 藥品

葡萄糖、瓊脂條、乙醇、乙酸乙酯、苯、乙醚、甲苯、環(huán)己烷、石油醚

1.1.4 儀器

RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、SHZ-D(III)循環(huán)水式真空泵、101型鼓風(fēng)干燥箱、SW-CJ-1D型超凈工作臺(tái)、GH-400BC隔水式恒溫培養(yǎng)箱、GMSX-280手提式高壓蒸汽滅菌鍋、電磁爐、燒杯、玻璃棒、紗布、培養(yǎng)皿、無(wú)菌打孔器、鑷子、接種環(huán)。

1.1.5 供試沼液

取自玉溪一沼氣工程的豬糞發(fā)酵沼液

1.2 方法

1.2.1 沼液的處理方法

用雙層紗布過(guò)濾，將大顆粒懸浮物濾去，待做濃縮實(shí)驗(yàn)

1.2.2 試驗(yàn)方法

(1)先在T=60℃，P=0.075-0.08 MPa使沼液去掉80%的水分[12]；

(2)待濃縮液冷卻至室溫后，用濃縮液和6種有機(jī)溶劑(乙酸乙酯、苯、乙醚、甲苯、環(huán)己烷、石油醚)1∶2的比例進(jìn)行單獨(dú)萃??；

(3)萃取分液后，用T≤60℃，P≤0.07 MPa來(lái)回收有機(jī)溶劑；

(4)待萃取物冷卻后，用來(lái)做抑菌試驗(yàn)；

(5)抑菌試驗(yàn)：將供試菌種接種于PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)至長(zhǎng)滿整個(gè)平板，放置備用。接著將萃取物、萃取后剩余物、有機(jī)溶劑、濃縮液、原沼液、無(wú)菌水分別依次取500 uL于平板表面涂布均勻，用打孔粘貼法進(jìn)行抑制尖孢鐮刀菌和腐皮鐮孢菌的實(shí)驗(yàn)。取布滿供試尖孢鐮刀菌和腐皮鐮孢菌的PDA培養(yǎng)基平板，用無(wú)菌打孔器(φ=9 mm)對(duì)平板進(jìn)行菌斑打孔，接著用鑷子小心地將菌種塊移入不同抑菌液處理的平板上，菌絲一面朝上，每個(gè)培養(yǎng)皿中放入3小塊菌種，并呈三角形放于平板中央，加蓋并標(biāo)記，放于30℃隔水式恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每培養(yǎng)24 h觀察測(cè)量菌斑的直徑[13,14]。

(6)待培養(yǎng)24 h以后，用十字交叉法測(cè)量菌塊生長(zhǎng)的大小。之后每24 h對(duì)菌塊進(jìn)行一次測(cè)量，一共測(cè)量4 d的數(shù)據(jù)[13,14]。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理方法

抑制菌絲生長(zhǎng)率計(jì)算采用生長(zhǎng)速率法[13-14]。

抑制數(shù)(cm)=對(duì)照平板培養(yǎng)基上菌落直徑-處理平板培養(yǎng)基上

菌落直徑

2 結(jié)果與分析

2.1 沼液萃取成分對(duì)尖孢鐮刀菌和腐皮鐮孢菌的抑制效果對(duì)比研究

不同極性的6種有機(jī)萃取劑對(duì)尖孢鐮刀菌和腐皮鐮孢菌具有不一樣的抑菌效果，抑制效果如圖1、圖2所示：

圖1 不同有機(jī)溶劑對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制效果

圖2 不同有機(jī)溶劑對(duì)腐皮鐮孢菌的抑制效果

從圖1來(lái)看，不同有機(jī)溶劑對(duì)尖孢鐮刀菌具有不同的抑制效果。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，環(huán)己烷的抑制效果呈現(xiàn)先下降再上升的趨勢(shì)，第1天為抑制效果的峰值；其中，甲苯、乙酸乙酯、苯、石油醚對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制效果呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在培養(yǎng)第2天出現(xiàn)抑制效果的峰值；其中甲苯對(duì)尖孢鐮刀菌具有較強(qiáng)的抑制效果，高達(dá)51%。

從圖2可看出，甲苯、乙酸乙酯、環(huán)己烷、乙醚4種有機(jī)溶劑對(duì)腐皮鐮孢菌的抑制效果隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而下降；苯和石油醚對(duì)腐皮鐮孢菌的抑制效果隨培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)并在第3天達(dá)到抑菌峰值；其中甲苯的抑制效果最強(qiáng)，高達(dá)31%。

2.2 不同有機(jī)溶劑萃取成分對(duì)尖孢鐮刀菌和腐皮鐮孢菌的抑制效果

不同有機(jī)溶劑萃取得到的物質(zhì)對(duì)尖孢鐮刀菌和腐皮鐮孢菌抑菌效果的影響如圖1和圖2所示。

由圖3和圖4可看出，各有機(jī)溶劑萃取物都對(duì)兩種病原菌具有較好的抑制效果，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，萃取物的抑菌效果也逐漸增強(qiáng)，但濃縮液和原沼液對(duì)兩種病菌的抑制效果隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。從兩個(gè)圖可看出，乙醚萃取得到的萃取物抑制效果最佳，最高可達(dá)71%，原沼液和無(wú)菌水對(duì)照的抑菌效果相對(duì)較差。從而也說(shuō)明沼液經(jīng)有機(jī)溶劑萃取濃縮后，抑菌效果得到提高，也說(shuō)明有機(jī)溶劑能提取出抑菌活性物質(zhì)加強(qiáng)其抑菌能力。

圖3 不同有機(jī)萃取劑萃取物對(duì)尖孢鐮刀菌的抑菌效果

圖4 不同有機(jī)萃取劑萃取物對(duì)腐皮鐮孢菌的抑菌效果

2.3 不同有機(jī)溶劑萃取后剩余物對(duì)尖孢鐮刀菌和腐皮鐮孢菌的抑制效果

不同有機(jī)萃取劑萃取濃縮液后的剩余物對(duì)尖孢鐮刀菌具有較弱的抑制效果，抑菌效果如圖5所示。

由圖5和圖6可看出，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加不同有機(jī)萃取劑萃取剩余液對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制效果均呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，在第4天時(shí)，所有萃取剩余物都失去對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制效果，抑菌率均下降為0%，各萃取剩余物均失去抑菌效果。

圖5 不同萃取劑萃取剩余物對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制效果

圖6 不同萃取劑萃取剩余物對(duì)腐皮鐮孢菌的抑制效果

2.4 各處理之間的差異性分析

2.4.1 對(duì)沼液的不同處理對(duì)尖孢鐮刀菌抑制效果的差異性分析

用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，可見(jiàn)表1。

表1 各處理間方差分析

從表1可看出，p<0.05各處理間存在明顯差異(具有顯著極差)。也說(shuō)明沼液在萃取濃縮前后抑菌效果變化較大，其中乙醚萃取物的抑菌效果最強(qiáng)，達(dá)到71%。但是其余5種有機(jī)溶劑萃取物的抑菌效果都相差不大，都在70%左右。說(shuō)明萃取濃縮可增大沼液中活性物質(zhì)的濃度，增強(qiáng)沼液的抑菌能力。

表2 各處理間的多重比較分析

注：5%顯著水平用小寫(xiě)字母標(biāo)記；對(duì)于不同處理，字母標(biāo)記相同的數(shù)據(jù)間不存在差異性，例如ab與ab，字母標(biāo)記不同的數(shù)據(jù)間存在顯著差異，例如a與bc，字母標(biāo)記中含有重復(fù)字母的數(shù)據(jù)間不存在顯著差異，例如a與ab。1%極顯著水平用大寫(xiě)字母標(biāo)記；對(duì)于不同處理，字母標(biāo)記相同的數(shù)據(jù)間不存在差異性，例如A與A，字母標(biāo)記不同的數(shù)據(jù)間差異達(dá)到極顯著水平，例如A與B，字母標(biāo)記中含有重復(fù)字母的數(shù)據(jù)間不存在極顯著差異，例如A與AB。

由表2可以看出，萃取物和萃取剩余物、原沼液、濃縮液及無(wú)菌水對(duì)照之間的抑菌率存在極顯著差異性。其中屬乙酸乙酯萃取物對(duì)尖孢鐮刀菌的平均抑菌效果最強(qiáng)，達(dá)56%?？偟膩?lái)說(shuō)各有機(jī)萃取劑的萃取物之間抑菌效果并無(wú)顯著差異性，但和萃取剩余物抑菌效果之間卻存在顯著差異性，從而也說(shuō)明6種不同極性的有機(jī)萃取劑都能提取出具有對(duì)尖孢鐮刀菌抑制效果的活性物質(zhì)。

2.4.2 對(duì)沼液的不同處理對(duì)腐皮鐮孢菌抑制效果的差異性分析

用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，見(jiàn)表3。

表3 各處理間方差分析

由表3可知，p<0.05，說(shuō)明各處理間對(duì)腐皮鐮孢菌的抑菌效果存在顯著差異性。其中要屬乙醚萃取物的抑菌效果最好，最高可達(dá)71%。無(wú)菌水對(duì)照組抑菌效果最差，甚至出現(xiàn)了促進(jìn)生長(zhǎng)的作用。

表4 各處理間的多重比較分析

注：5%顯著水平用小寫(xiě)字母標(biāo)記；對(duì)于不同處理，字母標(biāo)記相同的數(shù)據(jù)間不存在差異性，例如ab與ab，字母標(biāo)記不同的數(shù)據(jù)間存在顯著差異，例如a與bc，字母標(biāo)記中含有重復(fù)字母的數(shù)據(jù)間不存在顯著差異，例如a與ab。1%極顯著水平用大寫(xiě)字母標(biāo)記；對(duì)于不同處理，字母標(biāo)記相同的數(shù)據(jù)間不存在差異性，例如A與A，字母標(biāo)記不同的數(shù)據(jù)間差異達(dá)到極顯著水平，例如A與B，字母標(biāo)記中含有重復(fù)字母的數(shù)據(jù)間不存在極顯著差異，例如A與AB。

由表4可知，各萃取物和萃取剩余物、濃縮液、原沼液對(duì)腐皮鐮孢菌的抑菌效果存在極顯著差異性?？偟膩?lái)說(shuō)，苯萃取物對(duì)腐皮鐮孢菌的平均抑菌效果最佳，達(dá)59%。說(shuō)明對(duì)腐皮鐮孢菌具有最佳抑菌效果的萃取活性物質(zhì)和乙酸乙酯具有極相似性。但各萃取物之間對(duì)腐皮鐮孢菌的抑制效果并無(wú)明顯差異性，且萃取物的抑菌效果和萃取剩余物之間對(duì)腐皮鐮孢菌的抑制效果存在極顯著差異性，從而也說(shuō)明每一種有機(jī)萃取劑都能從濃縮液中提取到對(duì)腐皮鐮孢菌有抑制效果的活性物質(zhì)。

3 結(jié)論

6種有機(jī)萃取劑都對(duì)尖孢鐮刀菌和腐皮鐮孢菌具有一定的抑制效果，且抑制效果隨培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，主要原因是有機(jī)溶劑在30℃環(huán)境中逐漸蒸發(fā)，導(dǎo)致抑制效果變?nèi)酢?/p>

經(jīng)6種有機(jī)萃取劑萃取過(guò)后剩余的液體對(duì)尖孢鐮刀菌和腐皮鐮孢菌具有較弱的抑制效果，但在培養(yǎng)3 d后抑菌效果下降迅速，第4天時(shí)抑菌率下降為0%。

6種有機(jī)萃取劑萃取濃縮液對(duì)尖孢鐮刀菌和腐皮鐮孢菌具有較強(qiáng)的抑制效果，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，抑菌效果逐漸增強(qiáng)。另外經(jīng)萃取提取的物質(zhì)的抑菌效果強(qiáng)于濃縮液、原沼液、有機(jī)萃取劑及無(wú)菌水。不同有機(jī)萃取劑得到的萃取物的抑菌效果之間并無(wú)顯著差異性，說(shuō)明每種有機(jī)萃取劑都能萃取出對(duì)尖孢鐮刀菌和腐皮鐮孢菌有抑制效果的活性物質(zhì)。

綜上結(jié)果可知：各有機(jī)萃取劑都能在沼液中提取到對(duì)尖孢鐮刀菌和腐皮鐮孢菌有抑制作用的物質(zhì)，從而使沼液經(jīng)不同有機(jī)萃取劑萃取濃縮后抑菌效果大大加強(qiáng)，最高抑菌率≥60%。各有機(jī)溶劑萃取得到的萃取物之間的抑菌效果雖無(wú)顯著差異性，但總體來(lái)說(shuō)乙醚萃取物抑菌效果最佳，最高抑菌率可達(dá)71%。同時(shí)萃取過(guò)后的剩余液體并無(wú)明顯的抑菌效果，經(jīng)萃取前后對(duì)比也可看出：有機(jī)萃取劑的確是將沼液中的某些抑菌活性物質(zhì)從沼液濃縮液中萃取濃縮，使萃取剩余物基本失去了抑菌能力。