厭氧消化過程預警指標體系研究進展

吳怡然， 段 娜, 林 聰

(中國農業大學 水利與土木工程學院， 北京 100083)

厭氧消化作為一種環境友好型的清潔能源生產方式，將環境保護和能源回收有機地結合在一起。它是多種微生物共同參與、分階段有序進行的復雜串聯代謝過程，包括水解反應、產酸反應、產乙酸反應、甲烷生成4個階段。產甲烷菌對環境最敏感、代謝速率最慢，因此，甲烷生成階段往往是厭氧消化過程的瓶頸，水解酸化與產甲烷兩階段一旦失去平衡，系統內便會表現為有機酸的積累，即系統酸化，隨之甲烷生成受阻，二氧化碳分壓增大，厭氧消化過程失敗[1]。

為保證厭氧消化過程的穩定性，實際工程中，發酵過程傾向于控制在較低的有機負荷[2]，為提高反應底物的發酵效率，實現及時的預警調節，需要對系統進行精準的監控，一套合理的預警指標體系極為關鍵。過程分析技術(Process Analysis Technology, PAT)的發展提高了監控方法的工藝水平，利用光譜、電化學等技術在線解密復雜的生物轉化過程，使得厭氧消化過程控制更加靈敏、快捷，但仍需要一個精確的預警指標來劃定界限[3]。

厭氧消化過程失穩的早期預警指標研究受到世界各國的廣泛關注，目前厭氧消化系統失穩預警指標主要集中在揮發性脂肪酸(Volatile Fatty Acid, VFA)、堿度及其綜合指標、氫氣分壓、中間代謝產物以及微生物與酶活性等。針對不同的發酵情形，乙酸、氫氣和二氧化碳作為甲烷生成的直接前體，通常具有一定的預警性，但對于不易降解的物質，氣相指標較為遲緩；從原料成分角度來看，以碳水化合物為主要成分的原料代謝產物中短鏈VFA的積累最為顯著，而以蛋白質為主的原料，氨氮、芳香族化合物、蛋白酶活性等是其特有的指標，脂質含量高時，磷酸酯酶活性也是可能的預警指標。但一套預警指標體系通常只適用于某一種生物質在特定環境條件下的反應，不具備普適性。隨著實驗測試水平的提升，厭氧消化過程逐漸實現線上實時監控，單一的預警指標被綜合性指標取代，大量研究趨向于肯定微生物群體的重要意義而非傳統化學指標。本文旨在總結和梳理現有厭氧消化過程失穩預警指標及其特點，預警表征方法、過程監控方法與技術，為厭氧消化過程預警及監控研究提供基礎材料。

1 厭氧消化失穩預警指標體系

1.1 VFA，堿度及其綜合指標

在厭氧消化過程中，甲烷生成通常有兩種途徑，一是乙酸分解產生甲烷，二是氫氣與二氧化碳反應生成甲烷，其中，乙酸分解途徑產甲烷量約占總產甲烷量的70%，而乙酸來源包括直接生成和其他VFA的分解，因而，自預警指標研究之初，VFA及其耦合指標就受到了研究人員的廣泛關注。

1995年，Ahring[4]等在中溫條件下采用豬糞與牛糞混合物作為底物，采用縮短水力停留時間(Hydraulic Retention Time, HRT)、有機負荷過載、溫度變化3種方式進行了VFA作為預警指標的研究，結果表明，3種情形下VFA、丙酸與乙酸的比值都具有較好的預警性能。2010年，Boe[5]等人在中溫條件下采用牛糞作為發酵底物，通過添加葡萄糖、脂質、明膠和生物纖維使系統過載，同時進行沼氣產量，pH值，VFA等指標的線上、線下監測，結果顯示，當系統開始失穩時，乙酸含量快速升高，但隨產甲烷反應進行其數值下降亦十分迅速，顯示出較大波動，而丙酸變化相對遲緩，但預警性表現最為穩定，因此，研究者提出可綜合兩項指標共同預警。在較長時間跨度的研究中可發現，不同操作條件下，VFA類指標的具體預警酸種類有所不同，且VFA中部分組成成分的耦合指標相對更加高效。

VFA反應了系統酸化的情況，而堿度標志著系統承受酸化的能力，因此，近年來堿度以及兩者的數值關系或綜合指標也被認為是可行的預警指標，包括碳酸氫鹽堿度總堿度(Total Alkalinity, TA)，(Bicarbonate Alkalinity，BA)，VFA/TA等。在實驗研究中，Li[6]等人針對餐廚垃圾中溫厭氧消化系統進行了研究，通過縮短HRT進行過載及恢復后二次過載模擬，結果表明，總VFA濃度，VFA/TA，BA/TA的綜合指標可有效實現餐廚垃圾厭氧消化過程預警，預警時間從5天到13天。其中，VFA/TA表征著引起系統pH值降低的化合物與保持堿度的化合物之間的比例，可以較好地反映系統繼續承受酸化的能力。

針對特定的發酵原料，Kleybocker[7]等人提出了VFA與金屬離子濃度耦合的指標，實驗采用城市污水與菜籽油進行聯合發酵，結果顯示，隨著進料有機負荷(Organic loading rate, OLR)的提高，總VFA/Ca2+出現預警指示的日期比丙酸指示早6天，此外，丁酸和異丁酸也有較好的預警性。

1.2 氣相指標

基于甲烷產生過程理論，氫氣分壓升高表征著氫氣合成甲烷過程受阻，并會導致丙酸的積累，因而具有一定的預警價值。Boe[5]等人在牛糞厭氧消化研究中，通過添加易降解物質提高OLR，驗證了氫氣的預警性，但在其他研究中，由于原料降解緩慢、氣液相轉移延遲、溶解氫消耗等問題，氫氣分壓作為氣相指標對于有機負荷的變化并不敏感[7]。但與之相對的，丙酸分解過程中，氫氣分壓所體現的化學平衡還可以通過丙酸(鹽)與乙酸(鹽)的比值來體現，而后者作為液相指標相對更加靈敏。

此外，針對目標產物為甲烷的發酵類型，甲烷產量可以直觀的顯示厭氧消化系統的運行狀態，也具有一定的預警性能。

行政訴訟的司法審查側重于法律審。雖然稅收預約裁定訴訟是針對稅務機關不履行裁定之行為提起的訴訟，但仍然要對該行為的依據——預約裁定本身的合法性進行審查。預約裁定的法律性質為行政解釋，稅務機關應在不與上位法抵觸的前提下對稅法適用作出解釋。然而，稅務問題屬于高度復雜的專業領域，在當前法院稅務案件審判經驗尚缺的情形下，法院是否尊重行政解釋成為專業領域中行政解釋的司法審查所面臨的主要問題。

1.3 其他中間代謝產物

Hecht和Grieh[8]在實驗中發現芳香化合物在餐廚垃圾厭氧消化過程中的累積效應，除了已知的有毒代謝物如氨，硫化氫和VFA顯著升高外，芳香化合物濃度也隨OLR的增大而增加，其主要成分為苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸的厭氧降解中間體，在大多數實驗中，芳香族化合物特別是苯乙酸，出現波動較之VFA要更早，這表明了使用芳香化合物作為過程失穩預警指標的可能性。此外，還有學者提出用甘油、乳酸等中間代謝產物作為預警指標。

1.4 微生物多樣性

厭氧消化系統失穩時，微生物群落將對環境脅迫產生適應性變化。Poirier[9]等人通過投加5 g·L-1苯酚作為毒性物質，破壞厭氧系統穩定性，微生物測序結果顯示古細菌和細菌群落在毒性狀態下具有高水平適應性，進而提出微生物群落豐度作為預警指標的可能性。Lv[10]等人利用碳14標記產物甲烷，檢驗碳14的監測作用，同時熒光標記兩種產甲烷途徑的微生物群落，從而表征甲烷的生成途徑，對系統運行狀況進行評估。

1.5 酶活性

厭氧消化4個階段分別有多種酶參與反應，其中，水解過程是厭氧消化過程的開始，同時也是產甲烷的限速步驟[11]，在此過程中，發酵性細菌分泌的水解酶對底物的水解起著關鍵作用。國內外對厭氧消化中水解酶的研究主要集中在葡萄糖苷酶(Glucosidase)、蛋白酶(Protein Enzyme)、磷酸酯酶(Phosphatase)等[12-15]。 Ugwuanyi[16]等人在對淀粉廢水厭氧消化的研究中發現，當系統超負荷運行時，蛋白酶和葡萄糖苷酶的活性明顯升高，可作為潛在的評估厭氧消化過程穩定性的監測指標。磷酸酯酶是水解底物上磷酸基團的酶，其活性與磷酸酶產生菌和產酸菌的數量有關，因此也可用以判斷消化系統的酸化狀態。彭緒亞等在餐廚垃圾厭氧消化失穩研究中發現磷酸酯酶活性驟變較VFAs、容積產氣率超前2天，較pH值驟降超前1天[14]。

2 系統預警的表征方法

為確定指標是否達到預警狀態，已有研究主要集中在指標臨界值的判定，但在實際沼氣工程運行中，發酵環境、物料性質等差異性較大，臨界值的可參考意義很小，因此指標的預警性能判別與變動顯著性檢驗更為關鍵。

Angelidaki[4]等提出了一種簡單的顯著性評估方法，通過計算指標變化幅度：Z值，判別指標是否發生質的躍變。此外，多項指標綜合判定對系統酸化狀況評估具有重要意義，Cook[17]等人設計出了一種回歸分析的方法，量化表現系統運行狀態，值域在0到1之間，并劃定0.5為顯著失穩的臨界值。

更多的研究者傾向于直觀的從數值變化曲線來判斷指標變動情況，并與厭氧消化系統產氣潛能或甲烷產量曲線進行比較，從而判別指標變動日期與系統崩潰日期，進而對預警時間進行計算。

3 厭氧消化過程監控方法與技術

為實現厭氧消化過程的長期穩定進行，需實時監測過程各項指標波動，為可能的運行風險提供預警。過程指標測試方法的不斷優化為及時、快速的監控提供基礎。表1對應用于厭氧消化過程監測的常用測試方法進行了比較。

表1 厭氧消化過程監控常用測試方法比較

3.1 滴定法

比對各種監測方法，滴定法具有簡單易行、低成本的優勢。針對VFA積累引起的厭氧消化過程失穩，Feitkenhauer[18]等人提出了一種定量滴定短鏈揮發性脂肪酸(Short Chain Volatile Fatty Acids, SCVFA)的方法，該方法無需過濾，直接使用測量池滴定，計算機基于預設的VFA濃度自動調整滴定程序；通過模擬不同濃度、成分的工業廢水發酵，測試該方法的有效性，實驗數據顯示廢水濃度及成分的變化對檢測效果無顯著影響。

但是，滴定法在一些應用中誤差較大，需對計算方法進行修正。劉芳等[20]采用Nordmann聯合滴定法和精密儀器法對一項以OLR為變量的連續發酵實驗的總VFA與BA變化進行了測定，比對兩者測定結果發現，Nordmann聯合滴定法測定的VFA與BA質量濃度均值相對誤差均在50% 以上，且隨有機負荷的提高，相對誤差率降低。

3.2 色譜法

色譜法利用不同相態中，物質的選擇性分配原理，以流動相對固定相中的混合物進行洗脫，混合物中不同物質以不同的速度沿固定相移動，最終達到分離的效果。依流動相的不同分為氣相色譜、液相色譜等。該方法用于測定厭氧消化過程中間產物時，存在著易結垢、堵塞的問題[3]。Boe[21]等人開發設計了一種頂空氣相色譜的方法，利用一個樣品預處理池，通過調節溫度、pH值和離子濃度，降低樣品中揮發性化合物溶解度，并對頂空氣相進行取樣，利用溶解度關系確定個體VFA的濃度，該方法無需過濾，且不易導致堵塞。

3.3 紅外光譜與近紅外光譜

紅外光譜與近紅外光譜分析法均利用不同物質選擇性吸收紅外光區電磁輻射的原理進行化學過程監測。分子中不同的化學鍵或官能團吸收輻射的頻率不同，將紅外吸收光譜與標準圖譜進行比對可對物質進行定性，分析吸收峰位置及強度可對物質進行定量。該方法對試樣無破壞、用量少，且操作簡便、快捷。Steyer[22]等人在實際發酵工程運行中驗證了紅外光譜法測定VFA，COD，TOC，TA，PA的可行性，但其技術瓶頸在于必須配備一個超濾設備配合使用，解決方案即研究開發超濾設備的經濟替代物。Holm-Nielsen[23]等人在甘油作為添加劑的厭氧發酵研究中，采用了近紅外光譜分析測定VFA和甘油的含量，并認為該方法具有較好的精密度與重現性。

3.4 熒光法

利用熒光標記某些特定物質，比對標準熒光光譜，可進行定性、定量的分析，在厭氧消化過程研究領域，常用于標記還原性輔酶Ⅰ(Nicotinamide Adenine Dinucleotide, NADH)及一些輔酶。其中，NADH直接與生物代謝活動相關，其變化狀況可以表征出厭氧微生物的活性，Peck 和Chynoweth[24]在實驗中發現，當反應OLR過載時，熒光是最敏感的預警指標。輔酶F420是產甲烷菌特有的輔酶，趙全保[25]在人工合成廢水發酵的研究中，對反應物進行了OLR改變過程中的三維熒光分析，實驗結果顯示輔酶F420熒光峰對發酵酸敗現象顯示出較好的預警效果。

3.5 其他

利用水的介電常數與電磁波頻率變化關系，微波可用以檢測物質水分含量[26]，Nacke[27]等人利用這一性質提出了一種干物質定量系統，系統測量范圍為干物質2%～14%，研究者還依據實驗數據建立了單變量和多變量模型，用以監控厭氧消化反應器性能。

同位素追蹤法配合色譜法或質譜法檢測也曾被研究者用以厭氧消化過程研究。Polag[28]等利用碳14標記產物甲烷，檢驗了碳14的監測作用，實驗顯示，在連續高OLR條件下，碳14值的早期指示性較差，但穩定同位素值與微生物分析的數據比較顯示，主要甲烷生成途徑和碳同位素值之間有一定關聯，該發現可作為碳同位素追蹤法監控厭氧消化的理論基礎。

傳感器的應用有力的推動了線上監測厭氧消化過程的研究進展，Rudnitskaya和Legin[29]綜述了電子舌與電子鼻運用于生物反應過程監控的可能性，近年多變量方法的運用改善了傳統傳感器陣列低選擇性的問題，加之傳感器的廉價與堅固性使它們在監控復雜生物反應過程中具有一定優勢。但是，由于化學環境和采樣方法導致的管道結垢堵塞、樣品測試過程中降解等常見問題尚待科學研究。

4 總結與展望

4.1 預警指標體系的完善

從表2不同原料厭氧消化預警指標研究結果來看，各項指標中沒有一個指標是普適性的，針對不同的消化底物、運行條件，其預警性能顯示出不穩定性，如，Pullammanappallil[30]等認為丙酸作為預警指標時的臨界值為2750 mg·L-1，Nielsen[31]等提出的臨界值為1500 mg·L-1，而Kleybocker[7]等人在研究中發現丙酸并沒有出現較早的積累。此外，已有研究主要集中在以餐廚、禽畜糞便及廢水為底物的發酵過程，針對纖維素類生物質為底物的厭氧消化預警研究幾乎空白，不同工業產生廢水、多種底物混合發酵等眾多底物類型都亟待繼續探究，因此在未來的研究中，研究人員可針對不同類型的原料開展相關研究共同完善預警指標體系，這對于實際生產有著重要的指導意義。

4.2 適宜指標篩選

綜合文獻中所述，一個適宜的預警指標應具備3項顯著特征：

(1)易于測量，測試周期短。微生物活性、酶活性等都顯示出較好的預警性能，且更加深入的表征出厭氧消化系統的運行環境，但在實際運用中相對測試難度較高，測試周期長，因而在實用性角度，VFA、堿度等指標有著明顯的優勢。

表2 不同原料厭氧消化指標

(2)穩定性。多項指標在實驗中被證明雖然具有預警性，但數值波動大，實用性差，比如，乙酸具有較高的預警靈敏性，在短時間內可大量富集，但隨著反應的進行，乙酸直接分解產甲烷導致濃度銳減，預警狀態持續時間短，預警不穩定，難以判別系統內真實的酸化狀況[32]。

(3)靈敏性。最佳的預警指標體系應在物料滯留期內提供足夠長的預警時間，預警時間即某一參數表現出警示性到系統開始崩壞之間的時間間隔。

4.3 數據處理與建模

基于預警指標及臨界值的判斷，運用數學的方法統一標準化各項備選指標的數值，建立厭氧消化過程模型，可以更加科學、直觀地為精準生產監控服務。生化反應模型是在線過程控制方法的核心，目前可以較好的模擬厭氧消化過程的功能模型主要為國際水質協會提出的ADM1模型及其他學者提出的在某些特定情形下的變型。因此未來的研究發展方向可利用數學建模更加深入的揭示厭氧消化反應過程，為全面、快捷的在線監控提供理論支柱。