金錢魚Zar1基因克隆及其表達分析

何飛祥，江東能，陳華譜，鄧思平，吳天利，田昌緒，石紅娟，朱春華，李廣麗

（廣東海洋大學水產學院//南海水產經濟動物增養殖廣東省普通高校重點實驗室 // 廣東省名特優魚類生殖調控與繁育工程技術研究中心 // 湛江市海洋生態與養殖環境重點實驗室，廣東 湛江 524088）

脊椎動物受精和早期胚胎發育過程中存在卵母細胞特異的母源效應基因（Maternal effect gene，MEG），此類基因通常特異表達于卵巢組織及卵母細胞中。其在母體型向合子型調控的過渡期發揮重要功能，該轉錄表達調控過渡稱為母體-合子轉變或卵子-合子轉變（Maternal-zygotic transition, MZT）。至今，已在脊椎動物中鑒定出多種母源效應基因，包括Dnmt1、Gdf9、Bmp15、Mater、Zar1、Hsf1、Nalp5、Nalp9、Stella、Brg1、Nmp2、Fmn2、Basonuclin和Zfp36l2[1-3]。合子阻滯因子1（Zygote arrest 1，Zar1）是第一個在人和小鼠中發現的卵子-合子轉變中起關鍵作用的母源效應基因[4]。目前已在斑馬魚[3]、紅鰭東方鲀[5]、虹鱒[6]等魚類中開展了Zar1克隆和表達分析。Zar1在不同物種中的組織表達模式不同，主要表達于性腺和胚胎發育細胞中。小鼠Zar1在卵母細胞、1和2細胞期的胚胎中表達[4]；斑馬魚Zar1僅在卵巢中高表達，有著明顯的卵巢特異性，在斑馬魚的卵母細胞和整個胚胎期均可檢測到Zar1轉錄本，而在囊胚期后表達下降[3]。

雌性小鼠中純合敲除Zar1，產生的卵子可正常受精而形成合子，但多數胚胎停留在1細胞期而無法受孕[4]。雌性斑馬魚中敲除Zar1后的突變體導致早期卵母細胞凋亡和性腺出現雄性化，發生由雌向雄的性別逆轉，表明Zar1對于早期卵子發生的必需[7]。因此，Zar1作為卵巢特異表達的母源效應基因可能參與卵子發生和胚胎發育的調控過程。

金錢魚（Scatophagus argus），隸屬鱸形目（Perciformes）金錢魚科（Scatophagidae）金錢魚屬（Scatophagus），廣泛分布于印度洋到太平洋海域，是廣鹽性亞熱帶硬骨魚[8]。它是一種具有觀賞和食用價值的名貴海水經濟魚類。但是金錢魚的卵巢成熟比精巢晚，雌雄發育不同步，這導致其人工繁殖困難[9-10]。目前，在金錢魚的雌雄魚性別決定及其分化，以及生殖發育相關基因的調控方面已有較多研究報道[11-14]，而對于金錢魚在發育成熟之前的卵母細胞所特異的母源效應基因的研究鮮見報道。本研究通過克隆金錢魚Zar1基因，分析該基因在各組織中的表達情況，以及它們在不同性腺發育時期和胚胎發育過程中的表達模式，為Zar1在金錢魚生殖發育過程中的生理功能研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

金錢魚成魚購自廣東省湛江市東風水產品批發市場，體質量 200 ～ 350 g，體長 16.0 ～ 22.6 cm。挑取健康的性發育成熟個體，剖取心臟、肝、脾、胃、腎、鰓、肌肉、腸、下丘腦、垂體和性腺組織于液氮中速凍，移至-80 ℃超低溫冰箱保存，用于RNA提取及基因克隆、組織表達研究。另取部分卵巢組織用于其發育時期確定，雌魚每發育時期各取3尾，作為平行對照。不同發育時間胚胎樣本，從受精卵至出膜每1 h取樣1次，共對13個時間點取樣，每個時間點平行取樣3個，每個樣本各取20枚胚胎混合，受精卵或胚胎樣品采集時用DEPC（Sigma公司）水沖洗干凈。胚胎樣本為實驗室保存[15]。

1.2 總RNA提取和cDNA合成

采用Trizol試劑盒（Invitrogen）按參考說明書提取性腺總RNA。用10 mg/mL的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，并用Nanodrop 2000超微量核酸蛋白測定儀（Thermo Scientific）檢測提取RNA濃度和純度，-80 ℃保存以備用。然后以1 μg RNA為模板，按照 Prime Script? RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）（TaKaRa）說明書進行逆轉錄合成cDNA。

1.3 金錢魚Zar1基因克隆和序列分析

從 NCBI數據庫中下載大黃魚（Larimichthys crocea）、歐洲海鱸（Dicentrarchus labrax）和尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）的Zar1mRNA序列，將序列與本實驗室金錢魚轉錄組數據庫進行生物信息學比對分析[16]，找到金錢魚Zar1可能轉錄本，進而分別設計引物，引物由上海生工生物技術公司合成（表1）根據得到的金錢魚Zar1序列分別設計引物，引物由上海生工生物技術公司合成。采用2×PCR MIX試劑（東盛生物科技公司）進行基因序列PCR擴增。反應程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，循環35次；72 ℃延伸10 min。PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，目的片段用DNA凝膠回收試劑盒進行純化（N1072，東盛生物科技公司）。純化片段連接到 Peasy-T3載體（CT301，北京全式金生物技術有限公司）進行亞克隆，連接產物轉化到大腸桿菌感受態細胞，用含氨芐的固體培養基于37 ℃條件下培養箱中培養12 h。篩選陽性克隆送上海生工生物工程有限公司進行測序。使用ORF Finder （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）在線預測金錢魚Zar1的開放閱讀框（ORF），并利用EditSeq軟件翻譯其對應氨基酸序列。使用SMART（http://smart.embl－heidelberg.de/smart/）對蛋白結構和功能進行預測分析。利用Lasergene v 7.1.0軟件進行蛋白序列多重比對和同源性分析。使用 Clustal X1.83和Mega 6.0軟件用鄰接法構建系統進化樹。

1.4 逆轉錄PCR

取金錢魚各組織及卵巢不同發育時期的cDNA作為模板，采用逆轉錄PCR（Reverse transcription PCR, RT-PCR）方法檢測金錢魚Zar1基因在雌雄魚各個組織及其不同發育時期卵巢的表達。β-actin基因作為內參，引物如表1所示。用2×PCR MIX（東盛生物科技公司）在C1000TM Thermal Cycler（Bio Rad，美國）PCR儀上進行擴增。反應程序：94 ℃3 min；94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，擴增反應循環32次（β-actin循環28次）；72 ℃延伸10 min。PCR產物用20 mg/m L瓊脂糖凝膠電泳檢測，Tanon 2500R凝膠成像系統拍照。

表1 實驗所用引物Table 1 Primers used in present research

1.5 實時熒光定量PCR（qPCR）檢測

使用Zar1基因的特異性qPCR引物見表1，在Roche light CyclerTM 96實時熒光定量 PCR儀（Roche）上進行qPCR分析，檢測Zar1在卵巢和胚胎不同發育時期的表達，以β-actin作為內參基因。參照試劑盒說明書 SYBR?Green Real Time PCR Master Mix (TOYOBO，QPK-201)進行，反應體系 20 μL 為：PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各 0.8 μL（10 μmol/L），cDNA 模板 2 μL。反應程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，59 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s，共循環40次。運用2-ΔΔCt方法計算Zar1的相對表達量。

1.6 數據處理

數據結果采用平均值±標準差表示，各個時期使用3個平行樣本。采用SPSS 19.0進行單因素方差分析和Duncan多重比較，顯著性水平α= 0.05。

2 結果與分析

2.1 金錢魚Zar1序列分析

克隆得到金錢魚Zar1包含ORF的cDNA序列，ORF長為1 008 bp，編碼335個氨基酸（Genbank登錄號：MK736659）。利用在線數據庫平臺ExPASy分析 Zar1蛋白的理化特性，其蛋白分子量為 38 436.54，理論等電點為 9.72，蛋白質的不穩定指數為 41.94，疏水性平均值為-1.083，其脂溶系數為48.33。利用在線軟件對 Zar1蛋白的二級結構進行預測（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html），其氨基酸序列中α-螺旋占14.33%，β-轉角占3.28%，延伸鏈及無規則卷曲各占14.33%、68.06%。

2.2 Zar1基因同源性分析

將金錢魚Zar1氨基酸序列與人、小鼠、斑馬魚等其他物種蛋白進行多重序列比對發現（圖1），Zar1氨基酸的C末端序列非常保守，具有非典型的PHD 基序（Plant homeo domain）。其具有保守的C12結構模式，即（C-X2-C-X10-C-X12-C-X2-C-X13-C-X2-C-X4-C-X1-C-X17- C-X2-C-X6-C）。金錢魚 Zar1氨基酸序列中 236～321代表鋅結合域（zinc-binding domain），該結合域屬于一個具有多對CxxC基序的zf-3CxxC超家族成員，可能代表多個鋅結合區，有著半胱氨酸與高度保守的組氨酸殘基。將金錢魚Zar1氨基酸序列與其他物種進行同源比對顯示，金錢魚Zar1與大黃魚同源性最高，為85.1%，與小鼠同源性最低，為38.0%（表2）。另外，將金錢魚Zar1氨基酸序列與其他脊椎物種的Zar1氨基酸序列進行鄰接（neighbor-joining）聚類分析，構建系統進化樹（圖2）。發現金錢魚與鱸形目的大黃魚聚為一支，同源性較高，其親緣關系最近。而與人、小鼠、斑馬魚和非洲爪蟾相分離，結果表明金錢魚在進化上與鱸形目魚類親緣關系較近。

圖1 金錢魚Zar1與其他脊椎動物氨基酸序列的多重比對Fig.1 Comparison of Zar1 amino acid sequences between Scatophagus argus from other vertebrate

表2 金錢魚Zar1與其他物種的同源性分析Table 2 Homology analysis of Scatophagus argus Zar1 with other species

圖2 NJ法構建金錢魚Zar1與其他脊椎動物的系統發生樹Fig.2 Phylogenetic tree of Scatophagus argus Zar1 from other vertebrates based on NJ method

2.3 Zar1基因組織表達水平

通過RT-PCR方法分析Zar1在成年金錢魚的心臟、肝臟、脾、胃、腎、鰓、肌肉、腸、下丘腦、垂體、性腺各個組織中的表達水平。對照組β-actin在雌雄所有組織中均擴增獲得相似亮度的條帶。Zar1僅在卵巢中強烈表達, 獲得明顯的特異擴增條帶, 且擴增的片段長度與目的片段相一致，但未在其他組織中檢測到特異擴增條帶（圖3）。結果說明金錢魚Zar1基因具有卵巢特異性表達的特征

2.4 金錢魚不同性腺發育時期Zar1基因表達水平

為進一步驗證Zar1基因在金錢魚卵巢不同發育時期的表達水平，本研究使用 RT-PCR和 qPCR對金錢魚Zar1雌魚II期、III期和IV期的卵巢進行表達定量分析（圖4）。

結果顯示，Zar1在卵巢中的表達呈現出顯著遞增的趨勢，在 IV期卵巢中表達量達到最高。但 II期卵巢的相對表達量很微弱，與 IV期卵巢的表達水平形成顯著差異（P＜0.05）。

圖3 金錢魚Zar1在不同組織中的表達水平Fig.3 Zar1 expression in tissue of Scatophagus argus

圖4 金錢魚Zar1在卵巢不同發育時期的表達水平Fig.4 Relative expression level of Zar1 at different ovary development stages in Scatophagus argus

2.5 Zar1在金錢魚胚胎發育過程中的表達水平

金錢魚Zar1在胚胎發育時期的表達結果顯示，該基因在各個胚胎發育時期均有不同程度的表達（圖5）。從整體胚胎發育時期來看，隨著胚胎發育時期的變化，金錢魚Zar1的表達水平出現逐漸遞減的趨勢。在受精后的前 5 h，即原腸胚期之前，其表達量維持在較高水平。其中，在受精后1 h達到最高表達，即四細胞期。在受精后 3～5 h，即原腸胚期有顯微降低趨勢。6 h之后，即眼囊形成期呈現顯著的降低趨勢。之后則逐漸降低，直到孵化期一直維持在相對較低表達。在受精后15 h，即孵化期達到最低水平。

圖5 胚胎發育過程中金錢魚Zar1的相對表達水平Fig.5 Relative expression level of Zar1 during embryonic development stages in Scatophagus argus

3 討論

本研究通過克隆獲得金錢魚Zar1基因ORF全長1 008 bp，編碼335個氨基酸。金錢魚Zar1序列與其他物種進行同源性分析發現，金錢魚Zar1與大多數魚類的序列同源性較高，而與哺乳類和爬行類物種的序列同源性較低。系統進化樹分析顯示金錢魚Zar1與大黃魚緊密聚為一支，與其他鱸形目進化關系較為緊密，與傳統分類地位一致。金錢魚Zar1在C末端極其保守,具有非典型的PHD基序和鋅指結構。其PHD基序具有保守的C12結構模式，即（C-X2-C-X10-C-X12-C-X2-C-X13-C-X2-C-X4-CX1-C-X17-C-X2-C-X6-C）。所有物種 Zar1的 PHD基序都是非典型的C12模式，而不是典型的C8模式[17]。研究表明，非典型的C12模式PHD基序在轉錄調控中參與了與其它蛋白的相互作用，此外Zar1的PHD基序同樣含有鋅指結構[18-19]。Zar1的非典型 PHD基序可能參與基因轉錄調控過程[20]。因此，本實驗認為金錢魚Zar1可能作為轉錄因子而發揮作用。

金錢魚Zar1僅在金錢魚卵巢中表達，表明金錢魚Zar1是卵巢特異性表達基因。Zar1在有些物種也僅在卵巢中表達，如小鼠[5]、虹鱒[20]和斑馬魚[3]。而在有的物種中Zar1的組織表達范圍較廣，如Zar1在牛[21]、雞[17]和蛙[5]的卵巢之外的其他組織中也表達，包括肌肉、心臟、精巢等。目前，Zar1在不同物種組織表達差異的機制尚不清楚，有待后續研究。

金錢魚Zar1在卵巢各個時期均表達，且隨著卵母細胞的成熟逐漸升高。在斑馬魚中，Zar1在П到 IV期卵巢表達量都維持在較高的表達水平[3]。非洲爪蟾Zar1在卵子發生各個階段都表達，在卵子成熟過程穩定表達[22]。結果說明Zar1卵巢特異表達基因在卵子發育過程中發揮著重要作用。同時，分析Zar1在金錢魚早期胚胎發育過程中的表達水平，發現Zar1在受精后早期顯著表達，但在原腸胚期之后，出現逐漸降低的趨勢。這與母源效應基因的表達特征相一致，即由母體向合子的過渡可以細分為兩個過程，在轉變前的母體基因表達量顯著，而轉變后，母體mRNA和蛋白質逐漸降解而合子的轉錄過程開始[23]。在斑馬魚[3]、小鼠[4]中，Zar1在囊胚期到原腸胚期表達量顯著降低，之后保持在較低表達水平，非洲爪蟾Zar1的表達量在神經胚期明顯下降[24]。由此可知，金錢魚Zar1可能參與調節胚胎發育早期過程。

綜上，金錢魚Zar1作為一個重要的母源效應基因，具有在卵巢中特異性表達的特征。其在卵母細胞到胚胎的過渡過程中充當著重要角色，在卵子發育和胚胎發育過程中發揮著重要作用。