蝦夷扇貝內臟團對鎘的富集特性及生理響應

高加龍, 章超樺，秦小明，郝記明，張 靜，蘇偉明

（廣東海洋大學食品科技學院 // 國家貝類加工技術研發分中心(湛江) // 廣東省水產品加工與安全重點實驗室 //廣東省海洋生物制品工程實驗室 // 水產品深加工廣東普通高等學校重點實驗室，廣東 湛江 524088）

隨著現代工業的發展，包含重金屬在內的各種污染物被源源不斷地排入海洋環境，這些重金屬，即使濃度小，也可在藻類和底泥中積累，被魚和貝的體表吸附，產生食物鏈濃縮，從而造成公害。例如，汞（Hg）污染導致“水俁病”和鎘（Cd）污染導致“痛痛病”等。鎘是一種劇毒重金屬，能夠廣泛誘導環境中的生物體產生毒性反應，其毒性包括干擾各種代謝過程、膜運輸、蛋白質合成、DNA修復以及活性氧（ROS）的產生等[1-3]?；钚匝醯姆e累會造成組織生物膜、蛋白質及核酸的損傷。在正常生理學情況下，機體通過抗氧化防御機制防止活性氧的形成，通過清除活性氧修補損傷，限制活性氧產生的有害影響?？寡趸烙饕蛇^氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）等酶類抗氧化劑及維生素類抗氧化劑構成[2,4]。目前針對貝類重金屬脅迫影響的研究，主要集中在毒理學、抗氧化酶活性、功能基因研究和DNA損傷等[5-6]。在雙殼類動物中，環境污染可增強氧化應激，從而干擾天然抗氧化酶系統。研究報道，鎘、汞、鰻弧菌和副溶血弧菌可誘導櫛孔扇貝（Azumapecten farreri）、文蛤和貽貝等雙殼貝類中CAT、SOD的表達[7-9]。此外，熱休克蛋白 70（HSP70）是熱休克蛋白超家族的重要成員，具有細胞內分子伴侶和細胞外免疫調節功能，是受到熱激、重金屬、干旱、疾病、寄生蟲感染等條件脅迫后產生的誘導蛋白[10]。

蝦夷扇貝（Mizuhopecten yessoensis）是一種冷水性貝類，原產于日本北海道及本洲北部、俄羅斯千島群島的南部水域及朝鮮附近，目前已在渤海及黃海北部形成規模化和產業化養殖，是我國北方最重要的海水養殖貝類之一。蝦夷扇貝易于蓄積重金屬，尤其是鎘[11]。然而，目前關于實驗性金屬污染后蝦夷扇貝的生理反應和解毒過程的研究報道鮮見。因此，筆者以蝦夷扇貝為對象，研究在重金屬Cd脅迫下扇貝的生理指標響應及對 Cd的富集特征，以期為蝦夷扇貝的健康養殖、棲息地環境監測和海洋環境保護等提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活蝦夷扇貝（M.yessoensis），殼長（11.2 ±0.8）cm，購自日本東京筑地水產批發市場。

Trizol（Ambion公司，美國）；PrimeScriptTM RT Master Mix （Perfect Real Time）、SYBR? Premix EX TaqTM II (Tli RNaseH Plus) Kit（Takara 公司，日本)；CdCl2·2.5H2O為分析純；硝酸、高氯酸為優級純；鎘標準儲備液（國家標準物質研究中心）；Ultra Clam貝類飼料（Fauna Marin公司，德國）。

1.2 儀器與設備

ABI 7300 Real Time PCR System、ABI 3130 Genetic Analyser（Applied Biosystems公司，美國）；Biospec-nono 紫外分光光度計（島津公司，日本）；Thermo SOLAAR M6原子吸收分光光度計（Thermofisher公司，美國）；C-MAG HP10電加熱板（IKA公司，德國）。

1.3 方法

1.3.1 扇貝暫養及重金屬暴露 購買的鮮活扇貝先在實驗室的水族箱（90 cm × 45 cm × 45 cm）中用人工海水暫養7 d。暫養后隨機分為3組，每組20只，1組作為對照組（Control），在不添加重金屬的海水中飼養10 d；另2組分別在添加了200和400 μg/L CdCl2的人工海水中暴露10 d，每天完全換水并添加Cd至對應濃度。在暫養和暴露實驗階段海水溫度均控制在（18 ± 1）℃，自然光照周期，供氧泵持續曝氣，每天在海水中添加0.1 g/100 L的Ultra Clam作為飼料[12]。

1.3.2 扇貝組織收集 在暴露7 d和10 d后，分別從對照組和Cd處理組中隨機選擇5個扇貝。開殼取內臟團，于液氮中速凍后在-80 ℃保存，用于實時熒光定量 PCR測定；同時收集扇貝其余內臟團、外套膜、閉殼肌、腮和性腺組織，于-20 ℃保存，用于Cd含量測定。

1.3.3 扇貝鎘含量測定 為了減少取樣水分差異對測定結果造成的誤差，用于Cd含量測定的各組織預先在80 ℃干燥箱中干燥24 h以上。準確稱量已干燥的扇貝各組織0.30 g，置于三角燒瓶中，加入20 mL的硝酸+高氯酸（體積比7∶1）的混合酸，放置12 h，然后在電熱板210 ℃加熱消解2～3 h，不時補加混合酸至完全消解，再持續加熱除酸后定容，經0.22 μm濾膜過濾后用原子吸收分光光度計測定[13]。

1.3.4 總 RNA提取和第一鏈 cDNA合成 采用Trizol法提取扇貝內臟團的總RNA，運用瓊脂糖凝膠電泳驗證RNA完整性，用Biospec-nono紫外分光光度計檢測各 RNA濃度及純度，參照PrimeScriptTM RT Master Mix （Perfect Real Time）說明書合成實時熒光定量PCR cDNA模板。

1.3.5 實時熒光定量PCR檢測 以β-actin基因作為內參，cDNA為模板，ABI 7300 Real Time PCR進行 qRT-PCR。引物見表1，PCR反應體系參考SYBR? Premix EX TaqTM II說明書，20 μL 反應體系：10 μL 2 × SYBR? Premix Ex Taq，2 μL cDNA模板, 0.4 nmol/mL 引物，0.4 μL 50 × ROX reference dye，擴增程序為在95 ℃下變性30 s，然后在95 ℃下反應5 s，60 ℃下反應30 s，進行40次循環。為了評估PCR擴增的特異性，在qPCR周期結束時，收集65～95 ℃的熒光數據，在0.5 ℃增量下進行熔解曲線分析。最后用2-ΔΔCT方法計算基因的相對表達水平。

表1 本實驗所用引物Table 1 Primers used in the present study

1.3.5 數據處理 所有測試平行重復3次，結果以X±S表示。采用SPSS 22.0軟件對實驗結果進行統計學處理，使用單因素方差分析（ANOVA）和Duncan多重比較判斷組間差異的顯著性，顯著性水平為α= 0.05。

2 結果與分析

2.1 扇貝組織中鎘的分布

圖1 扇貝不同組織中鎘的含量Fig.1 Cd bioaccumulation in tissues of scallops

圖1是對照組的蝦夷扇貝不同組織中Cd的含量，其內臟團含有62 μg/g（干基）的Cd，各組織Cd濃度高低依次為內臟團＞ 腮＞外套膜＞ 性腺＞ 閉殼肌，內臟團中Cd濃度約為閉殼肌的108倍（P= 0.004）。與本研究結果相似的是，Evtushenko等[9]對日本海不同年齡的蝦夷扇貝中的 Cd進行檢測，發現1到8年齡扇貝內臟團中Cd質量分數從39 μg/g（干基）遞增到400 μg/g（干基），而腮、外套膜和閉殼肌中則低于6 μg/g（干基）?？梢姡鳛闉V食性動物，扇貝可以大量富集環境中的Cd，且絕大多數Cd富集在內臟團中。因此，本研究選用扇貝內臟團作為對鎘富集特性及生理響應的研究對象。

2.2 扇貝內臟團對鎘的富集

當扇貝暴露在含有Cd的海水中，內臟團中Cd含量持續增加。暴露于400 μg/L Cd海水7 d和10 d后，扇貝內臟團中的Cd質量分數由62 μg/g（干基）分別增加到了180和217 μg/g（干基），約為對照組的3倍左右，且與對照組呈現顯著性差異（P＜0.05）（圖2）。研究報道，菲律賓蛤仔、近江牡蠣和翡翠貽貝在含100 μg/L Cd的海水中暴露18 d后，組織中Cd含量分別為對照的20、17和25倍[14]。與以上3種雙殼貝類相比，本研究中蝦夷扇貝Cd富集倍數相對較低的原因可能是暴露天數相對較短（10 d），也可能是成年扇貝已經在棲息環境中富集了相對較高濃度的Cd（62 μg/g，干基）。

圖2 不同濃度鎘暴露下扇貝內臟團中鎘的富集Fig.2 Cadmium bioaccumulate in the digestive glands of scallops exposed to different concentrations of Cd

2.3 Cd暴露后扇貝內臟團誘導蛋白基因表達分析

越來越多的證據表明，鎘的積累通過過量產生ROS介導的氧化應激的誘導對生物體具有重大的負面影響[15]。為了研究鎘脅迫下扇貝內臟團的生理響應，對扇貝內臟團中CAT、SOD、GPx和HSP70的轉錄表達量進行了實時定量PCR分析。每個擴增產物（包括參比基因）的熔解曲線只有一個峰，經瓊脂糖電泳和ABI 3130 Genetic Analyser測序證實為目的產物，且β-actin mRNA的表達在實驗期間基本穩定。

圖3可見，Cd處理可誘導扇貝內臟團CATmRNA的表達。在含200 μg/L Cd的海水中暴露7 d后CAT的表達水平顯著升高，10 d后表達量則顯著回落，7 d后的表達量高于10 d后和對照組的5倍（P＜0.05）。而在含400 μg/L Cd的海水暴露時，CAT mRNA的表達在7 d后也明顯增加（P＜0.05)，但10 d后未見明顯下降（P＞ 0.05）。

圖3 鎘暴露下扇貝內臟團中CAT mRNA的相對表達量Fig.3 The relative mRNA expression of CAT in the digestive gland of M.yessoensis after Cd exposure

扇貝SODmRNA表達水平如圖4所示，在含200 μg/L Cd的海水中暴露7 d后表達量達的最高值，比對照組高28倍（P＜0.05），在10 d后表達水平則顯著降低（P＜0.05）。而在含400 μg/L Cd的海水處理10 d前扇貝SODmRNA表達無顯著變化（P＞ 0.05）。

圖4 鎘暴露下扇貝內臟團中SOD mRNA的相對表達量Fig.4 The relative mRNA expression of SOD in the digestive gland of M.yessoensis after Cd exposure

在含200 μg/L Cd海水中暴露，蝦夷扇貝GPx的mRNA表達明顯增強。在暴露7 d和10 d后表達量上升（分別比對照組增加22倍和17倍）（圖5）。在含Cd 400 μg/L海水中暴露，也導致了蝦夷扇貝GPxmRNA在暴露7 d和10 d 后表達上升（分別比對照增加9和8倍)，但差異無顯著性（P＞ 0.05）。

圖5 鎘暴露下扇貝內臟團中GPx mRNA的相對表達量Fig.5 The relative mRNA expression of GPx in the digestive gland of M.yessoensis after Cd exposure

蝦夷扇貝HSP70基因表達如圖6所示， Cd暴露后扇貝HSP70mRNA表達水平升高，200 μg/L暴露7 d組呈顯著性差異（P＜0.05），400 μg/L的Cd暴露10 d后表達量達幾組中的最高值，比對照組高 26 倍（P＜0.05）。

圖6 鎘暴露下扇貝內臟團中HSP70 mRNA的相對表達量Fig.6 The relative mRNA expression of HSP70 in the digestive gland of M.yessoensis after Cd exposure

3 討論

潮間帶濾食性無脊椎動物在其組織，特別是在內臟團中積累高水平的微量金屬，。內臟團不僅僅是用于消化的組織，也是對外來危害物質解毒和防御的組織[16]。因此，選擇內臟團來研究生物對 Cd的氧化應激反應。Cd暴露誘導扇貝內臟團中CAT表達顯著增加，說明CAT在Cd的解毒和免疫應答中起著重要作用，這在許多雙殼貝類的消化系統中得到了證實[17-18]。SOD存在于所有有氧細胞中，被認為對活性氧的毒性起著重要的保護作用。SOD在無脊椎動物中的表達可由熱刺激、重金屬暴露、微生物和有機污染物等各種挑戰誘導[8,19]。本研究中Cd誘導扇貝內臟團中SODmRNA的表達增加，提示SOD是保護生物體免受Cd毒害的抗氧化防御因子之一[20]。同樣，200 μg/L Cd誘導蝦夷扇貝GPx大量表達，說明扇貝GPx也參與抗氧化防御。GPx通過催化與谷胱甘肽（GSH）的反應去除H2O2，除了H2O2之外，該酶還催化其他氫過氧化物的還原，具有比過氧化氫酶更寬的保護范圍[21]。

Cd引起不同水平的生物系統的顯著代謝改變和損傷，以防止和修復鎘引起的細胞成分的損傷，對 ROS的防御機制的損傷導致 ROS濃度的增加[22]。這一事實可以解釋Cd暴露后抗氧化酶CAT、SOD和GPx基因轉錄的增加。在本研究中，Cd處理對CAT、SOD和GPx的表達均有影響，在鎘濃度為200 μg/L時，暴露7 d時3種酶的mRNA表達均顯著增加，但無論Cd處理為400 μg/L或暴露于10 d時，3種酶的mRNA表達水平均卻顯著降低。類似的結果表明，CAT活性的變化是急性應激期間對污染物的短暫反應，但在慢性污染生物體中并不明顯[23]，可能是CAT、SOD和GPx參與了抗氧化損傷的一線防御[24]。高劑量Cd或長期暴露會對扇貝造成危害，并造成不可修復的損害，在本研究中也發現，長期暴露高劑量Cd（400 μg/L）的扇貝死亡率相對較高。HSP70被稱為應對環境脅迫的經典反應蛋白，其含量高低對生物機體的損傷程度具有一定的指示作用[10]，當機體遇到重金屬脅迫等刺激時, HSP70 可通過防止蛋白的凝聚及變性, 維持細胞內環境穩定, 增強機體抗刺激及生存能力。本研究中扇貝在Cd脅迫下HSP70mRNA表達升高，在200 μg/L暴露7 d和400 μg/L暴露10 d條件下呈顯著差異，證實了這類蛋白在扇貝Cd暴露保護中起重要作用。然而扇貝中HSP70表達量與暴露時間和重金屬濃度并無線性關系，陳曉聰等[25]對菲律賓蛤仔的研究也出現相似結果，在2.5、5.0、7.5和10.0 μg/L汞中暴露后菲律賓蛤仔腮中HSP70mRNA表達量隨著暴露濃度增加呈先升高后降低最后又升高的趨勢，而在2.5和7.5 μg/L汞暴露48 h后mRNA表達量反而低于暴露24 h后的。

本研究是在實驗室內模擬了扇貝的急性Cd脅迫效應，能夠高效可控的探討貝類受毒性損傷的機理，可為扇貝的綜合利用開發及海洋環境的生物修復提供一些理論依據。但實驗室不能很好地模擬海域現場的溫度、鹽度和洋流特征等，而且在作用濃度和時間的設計上也很難模擬現場的情況，因此，今后考慮將實驗室模擬實驗和海域現場調查相結合，以便更真實反映海域現場的作用模式和毒性機理，更好指導貝類品質的控制，減少貝類資源衰退及防治海洋環境污染。

4 結論

蝦夷扇貝各組織易于富集環境中的Cd，尤其內臟團，是富集重金屬的主要組織。隨著鎘暴露時間延長，扇貝內臟團中Cd濃度急劇升高，內臟團中抗氧化酶CAT、SOD和GPx以及熱休克蛋白HSP70在Cd暴露后的基因表達量也顯著增加，說明其對Cd暴露的扇貝具有防御和保護作用。