弓背青鳉的胚胎發育及自發熒光觀察

張海瑞，王中鐸，黃順楷，汪 淳，郭昱嵩，董忠典，劉楚吾

（廣東海洋大學水產學院 / 南海水產經濟動物增養殖廣東普通高校重點實驗室，廣東 湛江 524025）

青鳉屬魚類在我國分布廣泛，有記錄為中華青鳉 （Oryzias sinensis）、小青鳉（O.minutillus）、弓背青鳉（O.curvinotus）、鰭斑青鳉(O.pectoralis)[1]，而日本青鳉（O.latipes）可能是中華青鳉的誤記[2-3]。青鳉屬魚類體型小，飼養方便，繁殖力強且周期短，胚胎透明，是研究發育生物學、環境毒理學的重要模式生物[4-5]。其對鹽度和溫度適應性廣[6]，可耐受低溶氧，生命力強，疾病少，可通過控制溫度和光照周期使其全年產卵[7]，且卵大透明，在顯微注射和細胞移植等方面具有獨特優勢，是進行基因功能研究的理想材料[8]。由于青鳉屬魚類的早期階段對污染物最為敏感，被廣泛應用于檢測環境內分泌干擾物、致癌污染物等[9-10]，是環境毒理學研究的重要模型動物。海水青鳉（O.melastigma）被認為是典型的胚胎毒性分析種類[10]，日本青鳉已被國際標準化組織推薦為毒性試驗的標準用魚之一[11]。

弓背青鳉隸屬于輻鰭亞綱（Actinopterygii）頜針魚目（Beloniformes）怪頜鳉科（Adrianichthyidae）青鳉屬（Oryzias），在我國廣東沿海分布廣泛，其性別分化明顯，發育早期既可用少量鰭條DNA通過性別特異性分子標記快速、準確地鑒定遺傳性別[12]，而成年魚的性別可結合觀察臀鰭的形狀準確區分。本課題組通過采樣調查發現，弓背青鳉棲息水域隨潮汐的漲落鹽度波動較大，其對鹽度波動的適應力強，有用于海水胚胎毒性分析的潛力。我國應用弓背青鳉胚胎進行毒性實驗及轉基因研究的工作基本鮮見報道，缺乏胚胎發育的基礎資料。筆者對弓背青鳉的發育過程進行連續觀察、記錄，以掌握胚胎各個時期的發育特點及胚胎發育過程中自發熒光的開始時期以及位置，為進一步研究提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 實驗魚

用手抄網采集廣東省廉江市高橋紅樹林區域的野生弓背青鳉，于實驗室馴養繁育，獲得F2代。養殖用水為海水晶配制的人工海水，鹽度為12，水溫控制在26 ℃；光暗周期比為14 h∶10 h；每日定時喂食鹵蟲幼體2次。

1.2 魚卵采集

實驗前1 d將1齡的F2代雌、雄親魚分開飼養，次日凌晨以雌雄比3∶2混養，約30 min后產卵受精。卵初排出時，卵與卵之間通過長絲相連，成簇地堆積在雌魚泄殖腔附近完成受精。在自然條件下，受精后數小時，卵黏附在水草上。為觀察完整的受精卵發育過程，受精完成后，取雌魚受精卵，去除卵間長絲。

1.3 胚胎發育觀察

取分離的受精卵，置于正置熒光顯微鏡下，連續觀察其發育過程。發育前期，每5 ～ 10 min觀察1次，發育至囊胚期后，每1 h觀察1次，器官形成期后每5 h觀察1次，對各時期典型的特征拍照記錄，參考Iwamatsu對日本青鳉胚胎發育時期的特征的描述[13]劃分弓背青鳉魚胚胎發育過程。分別在紅光熒光波長590 nm和綠光熒光波長515 nm觀察自發熒光現象，并記錄。

2 結果

2.1 胚胎發育過程

胚胎發育過程分為受精卵激活期、受精卵胚盤形成期、卵裂期、囊胚期、原腸胚期、神經胚期、器官形成期及孵化出膜期共8個時期。根據各期形態特征的變化，把早期發育過程細分為 35個階段（圖1）。

未受精卵子呈乳白色，不透明，略扁平，卵膜較厚；未受精前，卵膜和卵黃間隙難辨；胚孔位于卵膜動物極，漏斗狀；卵黃占的比例較大；大小不一的油滴均勻嵌在卵黃表面，油滴大小有個體差異。

2.1.1 受精激活期 受精后2 ～ 3 min，肉眼觀察卵呈半透明狀，略帶黃色，有一定硬度，卵內結構清晰可見，卵黃大而透明，位于卵中央。光鏡下可見嵌在原生質皮層中的皮質小泡開始破裂，位于動物極附近的皮質小泡首先破裂，植物極附近的小泡最晚破裂，其內容物進入卵膜與卵質膜之間，使卵黃周圍空間變寬，卵膜與卵質膜之間形成卵周隙。同時，卵膜變薄、變硬，卵黃之間的細胞質開始向動物極流動，在動物極處產生一清晰的細胞質區和一富含卵黃顆粒的植物區。

2.1.2 胚盤形成期 受精后45 min，卵子皮層的原生質向動物極流動，逐漸凸起形成胚盤。在此期間，之前均勻分散于卵黃的油滴開始逐漸相互融合并向植物極遷移。隨著時間的推移，油滴開始進一步融合，形成十余個略大的油滴，至該發育階段結束時，動物半球的大部分油滴已遷移至植物半球，使植物極密度減小而朝上，動物極密度大而朝下。

2.1.3 卵裂期 2細胞期（受精后1 h 20 min）。胚盤逐漸向內縊裂，第 1次卵裂為經裂，卵裂溝穿過胚盤，將胚盤分裂成 2個大小相似近半球形的卵裂球。

4細胞期（受精后1 h 55 min）。經向卵裂為4個大小相同的細胞。

8細胞期（受精后2 h 30 min）。第3次經裂成8個細胞，每行4個細胞。

16細胞期（受精后3 h 15 min）。第4次仍為經裂，分裂球排成4行，每行各4 個細胞，邊緣12個細胞較大，內部4個細胞較小。

桑葚胚早期（受精后4 h 15 min）。細胞數約為64 ～ 128，外周細胞略小而扁平。

桑葚胚晚期（受精后5 h 30 min）。細胞變得更小，細胞數約256 ～ 512。

2.1.4 囊胚期 囊胚早期（受精后6 h 45 min）。約為1 000個細胞，細胞更小，形成半圓形的胚盤帽。

囊胚晚期（受精后8 h 20 min）。卵裂球已開始不同步分裂和遷移，導致胚盤帽變低，。

2.1.5 原腸胚期 早前期原腸胚（受精后 10 h）。胚盤帽變扁平，覆蓋在卵黃球上，細胞層開始下包。

原腸胚早期（受精后 13 h）。胚盤覆蓋卵黃約1/4，胚盤周邊的細胞內卷形成胚環，將卵黃囊收緊；背部區域胚層細胞聚集形成胚盾。

原腸胚中期（受精后15 h 40 min）。胚盤覆蓋卵黃約 1/2，胚環清晰可見，胚盾面積增加，胚盾中間現一條淺的凹痕，是中樞神經系統原基——神經嵴。

原腸胚晚期（受精后20 h 50 min）。胚盤覆蓋約3/4卵黃。

2.1.6 神經胚期 早期神經胚（受精后 23 h 40 min）。植物極僅剩少部分卵黃——卵黃栓未被細胞覆蓋；柱狀胚體形成，其中一段形成頭部。

晚期神經胚（受精后 26 h）。胚體頭部兩側出現眼原基，胚孔未關閉前，尾部下方可見透明的Kupffer’s囊。

2.1.7 器官形成期 2肌節期（受精后28 h）。胚體現兩個明顯的肌節，眼泡后現耳囊原基突起。

4肌節期（受精后33 h）。前中后腦可辨3個區；中后腦兩側現體腔。

6肌節期（受精后38 h）。胚體中央現神經褶；眼泡中可見晶狀體，體腔向后擴張。

9肌節期（受精后42 h）。卵黃囊上現少量黑色素細胞；心臟原基出現在腦下部，眼分化出不完全晶體。

12肌節期（受精后46 h）。眼睛內可見完整的晶體輪廓，卵黃囊上現斑塊狀分布不一的黑色素斑塊，頭部現少量的棕紅色細胞——虹彩細胞。

16肌節期（受精后49 h）。心臟開始微弱跳動，居維氏管在頭部和胚體中部形成半循環，虹彩細胞開始擴散到胚體上。

19肌節期(受精后58 h)。心臟的跳動達到70-80次/分，主動脈可見血液流動，Kupffer’s囊完全消失。

24肌節期（受精后68 h）。胚體環繞5/8的卵黃囊，黑色素細胞開始在眼泡中沉積而變暗；尾部開始和卵黃分離。

30肌節期（受精后74 h）。胚體尾部約1/3完全脫離卵黃囊，虹彩細胞擴散到軀干上，黑色素細胞在頭部和軀干形成斑狀。

35肌節期（發眼期）（受精后97 h）。胚體環繞卵黃囊5/6，眼泡變黑，但晶體透明；耳囊內現2大透明膜突起，該時期也稱為發眼期。

鰓血管形成期（受精后112 h）。眼泡可以看到黑色的脈絡；血液可以在鰓弓中循環，心跳達90 ～110次/min，軀干出現不規律抖動。

肌節完成期（受精后124 h）。尾部完全脫離卵黃，胚體后部也有部分脫離卵黃囊，并不規律擺動。

脊索空泡化完成期（受精后132 h）。脊索已完全空泡化；眼泡完全黑化，強光下方可辨認晶體。

胸鰭血液循環期（受精后149 h）。胚體完全環繞卵黃囊，眼泡完全黑化；胸鰭經常擺動，出現血液循環；尾鰭現幾個黑色素團；尾尖到達眼部。

內臟血管形成期（受精后159 h）。胚體下頜形成，口腔在口凹處開放；血液循環通過內臟，軀體血液可見；尾尖伸展越過眼泡，虹彩細胞從頭部到尾端以分散方式分布，頭腹部區域現黃色素細胞團，主要為黃色。

心臟發育期（受精后170 h）。尾尖到達耳囊；心臟現明顯的心房和心室。

心包腔形成期（受精后8 d）。心臟發育完全，環繞心臟的心包腔突出；尾尖超過耳囊；腸道有一狹窄的內腔。

脾發育期（受精后9 d）。下頜和眼睛活動明顯。

圖1 弓背青鳉胚胎發育Fig.1 Embryonic Development of Oryzias curvinotus

2.1.8 孵化出膜期 孵化期（受精后10 d 20 h ～ 12 d）。尾鰭已達胸鰭后，胚體在卵膜內偶有翻轉；卵黃越來越小，卵膜變薄，胚體幾乎貼在卵膜上，該時期胚體已至出膜期。

仔魚出膜時，尾部抖動，破卵膜而出，軀體伸展開始后，再完全甩掉卵膜。剛出膜仔魚體長約3 ～4 mm，軀體有少量色素斑；卵黃囊橢圓形。

2.2 自發熒光

自發熒光主要是色素細胞內物質在激發光下產生的，所以自發熒光位置與色素細胞的出現和分布密切相關，發育至9肌節期時，胚體和卵黃上均出現黑色色素團，塊狀，位置無規律，于藍色和綠色激發光下并未自發熒光（圖2-1,2,3）。在12肌節期時，頭部先出現少量紅棕色細胞，此時在熒光激發出現自發熒光，亮度較暗；在 16肌節期時，紅棕色細胞團往身體部位遷移，呈樹突狀和梭狀，此時自發熒光較強，發光位置與紅棕色細胞團一致（圖2-4,5,6）；在35肌節期時，已開始遷移至尾部，熒光出現位置仍與紅棕色細胞團一致，但在身體上分布位置隨機（圖2-7,8,9）；在孵化期，熒光分布于頭部及脊索對應的體節上，呈點狀（圖2-10,11,12）；出膜后，其位置基本與孵化期一致（圖2-13,14,15）。

圖2 弓背青鳉胚胎發育過程中的自發熒光Fig.2 Spontaneous fluorescence during the development of Oryzias curvinotus embryonic

3 討論

3.1 受精卵油球

魚類油球成分主要是脂肪, 密度比水小，因此有油球的卵子一般是浮性卵[14]。然而，弓背青鳉的受精卵與海水青鳉[15]、中華青鳉[16]、日本青鳉[17]等其他青鳉屬魚類一樣為多油球沉性卵，其油球隨機地鑲嵌于卵周細胞質中，受精成功后, 油球逐漸融合。大瀧六線魚（Hexagrammos otakii）[18]、黃姑魚（Nibea albiflora）[19]、黃斑籃子魚（Siganus oramin）[20]、棘頰雀鯛（Premnas biaculeatus）[21]和半滑舌蹋（Cynoglossus semilaevis）[22]等硬骨魚類受精卵的油球融合發生在特定時期。王友紅等[15]提出，在多油球的魚類受精卵中，油球融合時期可作為發育時期的一重要特征。而弓背青鳉卵裂結束后形成數個聚于植物極的大油球的融合及數量變化并無明顯規律：有的在神經胚期便融合為一個大油球，有的在器官形成期油球尚未融合，因此，根據油球特征對發育分期并不適用于弓背青鳉。

3.2 Kupffer’s囊

Kupffer’s囊是一個內含單纖毛細胞(Monociliated cells) 的器官[23]。近年來研究證實，斑馬魚（Danio rerio）單纖毛細胞在Kupffer’s囊背腹部的不對稱分布會使內液逆時針流動，導致胚胎發育的不對稱性，從而啟動斑馬魚不對稱發育[24]，例如胃、心臟和脾臟就是典型的不對稱發育器官。然而，越來越多研究發現，并非所有硬骨魚類均有Kupffer's囊，大鱗鲃（Barbus capito）[25]、普安銀鯽（Carassius auratus）[26]、大瀧六線魚[18]等則無Kupffer’s囊，而在黃海大頭鱈（Gadus macrocephalus）的胚胎發育中僅 10%個體出現Kupffer’s囊[27]。本研究中，弓背青鳉所有胚體尾部均有Kupffer’s囊，且僅見于尾部位置；其出現于晚期神經胚階段，即胚孔關閉前。隨胚胎的發育，弓背青鳉的Kupffer’s囊會逐漸變大，但位置并不會改變；當發育至尾部將游離的 19體節期，Kupffer’s囊已逐漸消失，而此時器官尚未形成。海水青鳉Kupffer’s囊出現于胚孔關閉前，消失于器官形成的心臟跳動期[13]。因此，Kupffer’s囊對于青鳉不同物種不對稱性發育的作用是否存在明顯分化還有待進一步研究。

3.3 自發熒光原因

硬骨魚類色素細胞起源于神經脊細胞[28]，主要包括黑色素細胞、黃色素細胞、紅色素細胞、虹彩細胞[29-30]。色素細胞呈色方式有2種：一是細胞內含有色素，細胞所呈現的顏色是其所含色素的顏色；二是通過反射特定波長光的方式呈色[31]。從觀察結果來看，在只出現黑色素細胞時無自發熒光，至發育后期黑色素細胞位置亦無自發熒光；黃色素細胞出現的時間與自發熒光出現時間不一致；虹彩細胞出現時，自發熒光開始出現，且位置一致。可見自發熒光主要來自于虹彩細胞。研究表明，虹彩細胞的呈色物質主要是與水結合成晶體形式的嘌呤類物質，通過反射特定波長的光表現為白色、藍色和紫紅 3 種色彩結晶體[32]。在曼龍魚（Trichogaster trichopterus）中，虹彩細胞排列緊密，呈白色或銀白色，僅分布在鱗片表層[33]。橘色雙冠麗魚（Amphilophus citrinellus）虹彩色素細胞形狀不規則，與其他色素一起表現出不同的顏色[34]。本研究中，觀察到的虹彩細胞為棕紅色，點狀分布于脊索上方，起吸收紫外光[35]、保護神經索的作用。