構建三陰性乳腺癌的三維體外培養模型用于抗腫瘤藥物的活性評價

王 杰，李婷婷，李瑞紅，陳志強，周元園，王韞芳，柳 娟，張宏艷

乳腺癌是嚴重威脅女性生命健康的惡性腫瘤，在發達城市地區，其發病率逐年升高，據國家癌癥中心最新統計顯示，全國每年新發乳腺癌例數超過27萬，死亡例數超過7萬，位居女性惡性腫瘤發病率之首。其中，三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)的雌激素受體(estrogen receptor，ER)，孕激素受體(progesterone receptor，PR)和人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)均為陰性，具有惡性程度高、易復發轉移、生存率低的特點[1]。三陰性乳腺癌因其特殊生物學特征，易產生耐藥導致預后較差，因此研發能降低腫瘤耐藥性和預防腫瘤轉移復發的更為高效的抗腫瘤藥物就變得尤為重要。

通過組織工程技術的不斷發展，組織化培養的的腫瘤微組織已經被用于腫瘤生物學及分子機制研究，相較于二維(two dimensional，2D)培養，三維(three dimensional，3D)培養模型可以模擬腫瘤細胞在體生長狀態，并取得了大量的研究進展[2-3]。3D細胞培養支架為細胞培養提供了類似體內生長環境，因此選擇好的3D細胞培養支架材料也是成功進行3D培養的一個關鍵因素[4]?；|膠(Matrigel)是一種孔徑為20～50 nm的水凝膠基質，其主要成分為細胞外基質蛋白[5]。MDA-MB-231是一種ER、PR、HER-2均為陰性的乳腺癌細胞系，惡性程度高。該研究擬采用 Matrigel模擬腫瘤細胞外基質微環境，促進MDA-MB-231細胞形成3D類組織結構，采用液滴重疊法構建體外腫瘤細胞3D培養體系，對臨床常用抗腫瘤藥物進行藥物藥效學評價，旨在構建一種能夠真實模擬反映體內抗腫瘤藥物敏感性的基于Matrigel的3D腫瘤微組織培養模型(3D-M)；使用流式細胞儀在2D、3D及3D-M培養條件下腫瘤細胞對藥物的內吞情況，探索不同模型所檢測的藥物敏感性差異的機制。

1 材料與方法

1.1藥物、試劑與儀器多西紫杉醇注射液(docetaxel injection，DTX，英國安萬特醫藥有限公司)；鹽酸表柔比星注射液(epirubicin hydrochloride for injection，EPI，海正輝瑞制藥有限公司)；酒石酸長春瑞濱注射液(vinorelbine bitartrate injection，NVB，江蘇豪森藥業股份有限公司)；氟尿嘧啶注射液(fluorouracil injection，5-Fu，天津金耀藥業)；注射用環磷酰胺(cyclophosphamide for injection，CTX，百特國際有限公司)；順鉑注射液(cisplatin injection，DDP，江蘇豪森藥業股份有限公司)；注射用鹽酸吉西他濱(gemcitabine hydrochloride for injection，GEM，江蘇豪森藥業股份有限公司)；紫杉醇注射液(paclitaxel injection，Tax，海口奇力制藥有限公司)；依托泊苷注射液(etoposide injection，VP-16，齊魯制藥有限公司)；DMEM培養基(美國Gibco公司)；胎牛血清 (以色列bioligical industries公司)；Matrigel基質膠(美國BD公司)；Alamar Blue(美國Invitrogen 公司)；96孔板(美國Costar公司)；Attune NxT流式細胞儀、CO2培養箱(美國Thermo Scientific公司)；Vectra熒光顯微鏡、Ensight微孔板檢測儀(美國PerkinElmer 公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養 MDA-MB-231細胞培養于含 10% 胎牛血清、100 μg/ml 青霉素、100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養基中，于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養箱中培養，隔天換液，待其匯合度達到90% 左右，用含0.02% EDTA的0.25%的胰蛋白酶消化傳代。

1.2.23D與3D-M腫瘤微組織的構建 將Matrigel基質膠用4 ℃ DMEM培養基稀釋成10 μg/ml，低吸附的96孔U型孔板每孔50 μl包被，靜置10 min 左右，將50 μl MDA-MB-231細胞懸液分別以50、100、200、400、600、800、1 200、1 600、2 000個/孔加入孔板混合均勻，于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養箱中培養5 d，期間鏡下觀察細胞形態并拍照記錄3D微組織的變化。確定MDA-MB-231腫瘤微組織構建的最適細胞數，將MDA-MB-231以最適細胞數接種于無Matrigel包被的低吸附的96孔U型孔板中，并定期觀察。將MDA-MB-231細胞在3D、3D-M條件下培養5 d的腫瘤微組織，收集后4%多聚甲醛固定，依次經70%酒精20 min，95%酒精20 min，100%酒精2×20 min，二甲苯2×20 min梯度脫水；石蠟包埋切片，脫蠟后經蒸餾水洗3次，Harris蘇木精-酸化伊紅染色，再經脫水透明后封片拍照。

1.2.3Alamar blue法檢測細胞增殖 取對數生長期的MDA-MB-231細胞接種，2D培養的細胞以3×103個/孔接種于96孔板中，3D及3D-M培養的細胞以600個/孔分別接種于無基質培養基和Matrigel(10 μg/ml)包被的低吸附的96孔板培養，在0、1、2、3、4、5 d時分別檢測12個孔，每孔加入10 μl的Alamar blue試劑，混勻后置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養箱2 h，Ensight微孔板檢測儀檢測Ex 570 nm、Em 585 nm的熒光值，用于評測細胞活性。

1.2.4抗腫瘤藥物活性檢測 取對數生長期的MDA-MB-231細胞接種，2D培養的細胞以8×103個/孔接種于96孔中，24 h過夜貼壁后加化療藥進行細胞毒性測試。3D及3D-M培養的細胞以600個/孔分別接種于無基質和10 μg/ml Matrigel包被的低吸附的96孔板培養，5 d后加化療藥進行細胞毒性測試，DTX、EPI、NVB、5-Fu、DDP、Tax、VP-16濃度分別為0.01、0.1、1、10、100 μg/ml，CTX、GEM濃度分別為0.1、1、10、100、1 000 μg/ml。2D、3D及3D-M培養的MDA-MB-231細胞在給藥24 h后，每孔分別加入10 μl 的Alamar blue試劑，混勻后置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養箱2 h，Ensight微孔板檢測儀檢測Ex 570 nm、Em 585 nm的熒光值，用于評測細胞活性。

1.2.5流式細胞儀檢測化療藥物進入腫瘤微組織的情況 將MDA-MB-231細胞在2D、3D及3D-M 條件下培養5 d，棄培養基，各加入含有10 μg/ml EPI的DMEM培養基，加藥作用時間為0、10、30、60 min時，棄培養基，預冷的PBS洗3遍，將2D、3D和3D-M培養的細胞消化為細胞懸液分別收集于1.5 ml離心管中，使用流式細胞儀檢測MDA-MB-231細胞內吞EPI的量。

2 結果

2.13D培養乳腺癌微組織的形態表征鏡下觀察表明Matrigel可以促進MDA-MB-231細胞成球，細胞數偏低和偏高均不能和基質相契合，僅在400～800 個細胞/孔時，MDA-MB-231細胞可以和Matrigel充分結合，形成致密立體結構，故確定以MDA-MB-231細胞(600/孔)與50 μl Matrigel(10 μg/ml)共培養時可以形成3D微組織，見圖1。在2D單層培養條件下，鏡下乳腺癌 MDA-MB-231細胞貼壁生長，癌細胞大小不等成巢狀匯集，癌細胞呈現多邊形、梭形、橢圓形。在用低吸附U型底96孔板3D培養乳腺癌MDA-MB-231細胞時，加Matrigel共培養時可以聚集成緊密的球形，而未加Matrigel培養的微組織鏡下較為松散。在3D和3D-M培養的腫瘤微組織石蠟切片HE染色時，3D培養的微組織細胞呈現類圓形，3D-M共培養的腫瘤微組織更為緊密，見圖2。

2.2MDA-MB-231細胞在不同培養條件下增殖情況比較將MDA-MB-231細胞在2D、3D和3D-M培養條件下1～5 d的細胞計數做增殖曲線時，可以發現2D培養較3D培養增殖快，呈指數型增長；3D培養時生長速度較慢，加Matrigel時細胞增殖較不加Matrigel時快，表明Matrigel能夠促進MDA-MB-231的細胞增殖，見圖3。

圖1 MDA-MB-231細胞三維培養的形態表征

圖2 MDA-MB-231細胞培養條件下的生長情況及染色

2.3使用不同培養條件下的MDA-MB-231細胞進行抗腫瘤藥物活性檢測結果MDA-MB-231細胞在2D、3D和3D-M培養條件下，使用臨床常用一線化療藥物DTX、EPI、NVB、5-Fu、CTX、GEM、DDP、Tax、VP-16，在多濃度條件下分別做藥物敏感性實驗，通過比較藥物20%抑制濃度(IC20)值，3D培養條件下的IC20值大于2D培養，3D-M培養條件下的IC20值大于3D培養，測試DTX、EPI、NVB、5-Fu、CTX、GEM、DDP、Tax、VP-16的 IC20，3D分別為2D的11.7、2.3、46.5、12.7、769.2、8.1、1.7、11.7、0.7倍；3D-M分別為3D的4.4、7.6、1.9、1.6、1、1.4、416.7、0.8、5.9倍，可以發現3D-M培養條件下的細胞對化療藥物毒性反應的敏感性較差，耐受性高，反映出較強的耐藥性，見表1、圖4。

圖3 MDA-MB-231細胞在2D、3D和3D-M 培養條件下

表1 MDA-MB-231細胞體外24 h藥物毒性

2.4藥物在不同培養條件下的MDA-MB-231細胞的含量分析EPI是一個帶自發熒光的臨床一線化療藥，能夠在488 nm的激發光下，發射紅色熒光。通過觀察MDA-MB-231細胞在不同培養條件下不同作用時間時對EPI的內吞，可以直觀地比較MDA-MB-231細胞中藥物含量的變化。在流式細胞儀檢測MDA-MB-231細胞內吞EPI實驗中，藥物作用時間分別為0、10、30、60 min，作用時間越長，內吞藥物的MDA-MB-231細胞的陽性細胞率越高，中位熒光強度越強；3D培養條件下細胞內吞藥物的陽性細胞率和中位熒光強度較2D培養低，3D-M相較3D培養條件下的陽性細胞率和中位熒光強度偏低，在藥物作用10 min時，3D-M的陽性細胞率和中位熒光強度較低，分別為3D的71%和54%，30 min時，3D-M的陽性細胞率和中位熒光強度較低，分別為3D的80%和25%，60 min時，3D-M的陽性細胞率和中位熒光強度較低，分別為3D的93%和27%，見圖5。

3 討論

傳統的細胞培養法多采用2D單層平面培養，實際上許多細胞從組織中分離并進行2D培養后，會貼壁生長逐漸失去極性，導致異常分化甚至失去分化表型[6]。2D培養的MDA- MB-231細胞生長速度較快，培養箱過夜24 h內便可以貼壁，生長2～3 d細胞匯合度便可達到80%以上。其無論以何種細胞密度進行無基質介導的3D培養，自身均難以進行微組織化培養。MDA-MB-231細胞600/孔和50 μl 的Matrigel(10 μg/ml)在U型低吸附96孔板共培養5 d可以形成3D腫瘤微組織。3D培養條件下，腫瘤細胞的增殖速率較2D減慢，細胞生長周期延長，可以進行長時間、動態的細胞觀察和檢測。

2D細胞培養是現在研究腫瘤細胞生物學的主要方法，但在2D培養體系下建立的2D細胞培養體外模型，不能很好地模擬體內腫瘤細胞與微環境之間的相互作用，研究的耐藥機制也不能完全說明體內實際的耐藥機制[7]。與傳統2D培養相比，3D細胞培養既可模擬體內細胞生長的微環境，又有更直觀性和條件可控的優勢。David et al[8]在對2D和3D培養條件下的肺癌細胞研究時發現，肺癌細胞2D培養時細胞間相互作用較難實現，而3D培養的細胞間緊密連接，更利于傳遞生物信息，更接近體內細胞的分化程度、超微結構等生物特征。

以往研究表明，3D細胞培養技術能更好的模擬在人體內細胞的生長微環境。3D培養的體外腫瘤微組織細胞具有與體內腫瘤細胞相似的耐藥性，但當腫瘤微組織被消化為單細胞后，腫瘤細胞對藥物的耐受性大幅降低。Graham et al[9]研究證實乳腺癌細胞EMT6經過3D培養后具有耐藥性，但改為2D培養后其藥物耐受性顯著降低。Matrigel是一種細胞外基質蛋白的提取物，可以為細胞提供物理支撐，還能使細胞快速黏附，并充分接觸到細胞外基質，為細胞提供近似于體內的立體微環境[10]。Matrigel可以為MDA-MB-231細胞構建一個生長的微環境，并可以促進MDA-MB-231細胞的增殖，能夠真實模擬腫瘤細胞體內的生長狀態。Wang et al[11]在 Matrigel中培養人乳腺上皮細胞(MCF10 A)以及成纖維細胞和脂肪細胞等乳腺間充質細胞，經過3D培養，促使組織形成類似體內的乳腺腺泡狀結構，乳腺間充質細胞表現出與體內相似的生物學特性，如極性的維持及上皮細胞功能性分化等，說明3D培養比2D培養更能模擬體內微環境。大量研究[12-13]也表明，3D培養模型優于2D細胞培養模型。

圖4 MDA-MB-231細胞在2D、3D和3D-M培養條件下的抗腫瘤藥物活性檢測

圖5 流式細胞儀檢測化療藥物進入不同培養條件下腫瘤微組織的情況

據文獻報道，TC-71 EW腫瘤細胞經3D支架培養后，對阿霉素有較強的耐藥性，其IC50為2.738 mmol/L，而經2D貼壁單層培養的 TC-71 EW腫瘤細胞對阿霉素的敏感性顯著增高，其IC50為0.012 2 mmol/L[14]。本研究采用 Alamar blue法進行乳腺癌細胞藥物敏感性檢測，通過比較多種藥物IC20值，3D培養條件下的IC20值遠大于2D培養，3D-M培養條件下的IC20值遠大于3D培養，差異有統計學意義，可以發現在3D-M培養條件下的細胞對化療藥物毒性反應的敏感性較差，表明3D-M條件下培養腫瘤細胞對化療藥物有較強的耐受性。Matrigel 3D培養時MDA-MB-231細胞可形成致密的立體球形結構，在進行測試抗腫瘤藥物活性時，2D培養的細胞可以和藥物充分接觸，進入細胞內的藥物濃度較高，藥物更容易起效；Matrigel 3D細胞球能夠模擬實體瘤獨特的ECM微環境，降低藥物擴散速度，細胞間相互作用增強，所形成的致密結構使藥物不能大量進入球體內部，導致3D腫瘤微組織總體內吞藥物較2D培養少，差異有統計學意義，因此3D培養時IC20值遠大于2D培養，此時腫瘤細胞產生了耐藥性。蔣喬 等[15]在構建腫瘤微組織細胞球的模型時，也發現致密結構可以降低藥物擴散，促進細胞存活產生耐藥。

綜上所述，基于Matrigel和乳腺癌MDA-MB-231細胞共培養體外模型，可真實模擬腫瘤細胞體內生長，可作為抗腫瘤藥物體外篩藥模型，為藥物研發和臨床用藥提供理論指導。使用Matrigel 3D培養MDA-MB-231體外腫瘤微組織模型，也可以為體外乳腺癌耐藥性研究和信號通路機制研究提供研究模型。

(致謝：感謝劉端祺教授在論文的撰寫與修改方面提出的寶貴建議。)