雙酚A對高脂飲食小鼠肝損傷與GSK3表達的影響

葛曉蕾，陸曉桐，張小飛，吳 明，杜志遠，朱啟星，沈 彤

雙酚A(bisphenol A，BPA)是一種常見的環境內分泌干擾物，主要做為合成聚碳酸酯、環氧樹脂等塑料的單體，用于制造食品包裝材料及輸液袋等日常用品。當遇到熱或強酸強堿時，BPA會從其中釋出并進入機體，對人體造成危害[1-3]。研究[4-7]顯示BPA暴露可導致肝臟明顯損傷，而且炎性細胞因子參與其中，但BPA暴露誘導肝損傷中炎性細胞因子表達及調控機制目前知之甚少。糖原合成酶激酶3(glycogen synthase kinase 3，GSK3)是體內廣泛表達的多功能絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其氨基端的絲氨酸(GSK3α-Ser21或GSK3β-Ser9)磷酸化可顯著抑制其活性，調節炎性損傷[8]。該研究通過檢測BPA暴露小鼠在正常飲食(normal diet，ND)和高脂飲食(high fat diet，HFD)喂養情況下肝損傷、炎性細胞因子白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)表達以及GSK3蛋白表達情況，探討BPA暴露與HFD協同誘導肝臟炎性損傷與GSK3蛋白表達的關系。

1 材料與方法

1.1試劑和儀器BPA(99.9%分析純)購自國藥集團化學試劑北京有限公司；二甲亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)購自美國Sigma公司；BPA用DMSO溶解(DMSO終濃度不超過1%)；兔Anti-GSK3α抗體、Anti-GSK3α-S21抗體、Anti-GSK3β抗體、Anti-GSK3β-S9抗體購自美國Abcam公司；兔Anti-IL-1β抗體、Anti-TNF-α抗體購自武漢Elabscience生物公司，小鼠抗β-Actin單抗和通用超敏組化試劑盒、辣根過氧化物標記山羊抗兔IgG抗體、辣根過氧化物標記山羊抗鼠IgG抗體購自北京中杉金橋生物有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；倒置熒光顯微鏡 IX73購自日本奧林巴斯有限公司；ELX800 酶標儀購自美國Bio-Tek公司；Fine-do X6顯影儀購自上海天能科技有限公司；Microfuge?22R超速冷凍離心機購自美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.2實驗動物及其處理SPF級4周齡雄性C57BL/6野生型小鼠96只，體質量(14.53±0.97)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼養于安徽醫科大學動物實驗中心清潔動物房，自由進食，溫度(21±2)℃，濕度(50±5)%，12 h交替照明。適應性飼養1周后，隨機分為8組，每組12只。ND(12%脂肪能量)和HFD(45%脂肪能量，購自南京協同醫藥有限責任公司)各喂養4組。ND和HFD喂養小鼠分別設溶劑對照、10、100和1 000 nmol/L BPA組，通過飲水暴露于BPA，每2 d換1次水以保持飲水中BPA含量。每日觀察小鼠一般狀態，記錄飲水量和飼料消耗量，每周稱體質量1次。8周和12周時分別麻醉頸椎脫臼處死小鼠6只，無菌收集肝臟組織，稱質量并計算臟器系數，分別用于以下實驗。臟器系數計算方法：臟器系數=臟器質量(g)/小鼠體質量(g)。本研究在安徽醫科大學實驗動物倫理委員會的批準下，按照安徽醫科大學實驗動物規范進行。

1.3HE染色觀察小鼠肝臟組織病理學改變用10%中性福爾馬林固定小鼠肝臟組織24 h，常規石蠟包埋(脫水、透明、浸蠟、包埋)，制成5 μm切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，脫水，用二甲苯透明，中性樹膠封裝，顯微鏡下觀察各組肝組織病理學變化。

1.4免疫組化染色(IHC)檢測肝臟組織TNF-α、IL-1β的表達新鮮肝組織用4%多聚甲醛固定24 h，脫水，石蠟包埋，制成5 μm切片，正常脫蠟水合，用Triton X-100進行細胞通透，用正常羊血清封閉，甩去羊血清，用小鼠抗TNF-α抗體、抗IL-1β抗體4 ℃冰箱孵育過夜，室溫下復溫30 min～1 h，然后用過氧化物酶結合的二抗37 ℃孵育15 min，PBS充分清洗后，再用辣根酶在37 ℃孵育15 min。PBS充分清洗后，DAB顯色，蘇木素復染，干燥、封片，顯徽鏡下觀察拍片。

1.5Westernblot檢測肝臟組織GSK3α、GSK3α-S21、GSK3β、GSK3β-S9的表達肝臟組織勻漿后提取總蛋白并定量，經SDS-PAGE變性凝膠電泳分離，轉至PVDF膜，純水洗滌3次，加入一定濃度的一抗，包括Anti-GSK3α抗體、Anti-GSK3α-S21抗體、Anti-GSK3β抗體、Anti-GSK3β抗體、Anti-GSK3β-S9抗體蛋白(美國Abcam公司)，4 ℃過夜。復溫后用TBST洗滌3次，加入稀釋的二抗室溫孵育1.5 h，最后用TBST再次洗滌(3×5 min)。將化學發光試劑A和B(美國Advansta公司)以1 ∶1混合并滴加到PVDF膜上，通過顯影液顯影。用凝膠圖像處理系統(Image J軟件)進行相對OD分析。GSK3α、GSK3α-S21、GSK3β、GSK3β-S9分子量分別為51、50、46、46 ku。

2 結果

2.1BPA暴露對小鼠一般狀況和肝臟系數的影響實驗期間，各組小鼠一般狀態良好，未出現死亡現象。不同時間點，各組小鼠日平均飲水量和食物消耗量差異無統計學意義。與ND喂養小鼠比，同一時間點，8周和12周時各組間差異均無統計學意義。見表1。

2.2BPA暴露對小鼠肝臟組織病理學影響與ND喂養小鼠比，同一時間點HFD喂養小鼠肝臟組織肝小葉結構模糊，肝細胞排列紊亂，細胞腫脹明顯，大泡樣脂肪變性嚴重，炎性細胞浸潤增多；ND或HFD喂養小鼠中，肝臟組織病理學改變呈BPA暴露劑量依賴性，12周時較8周時炎性浸潤更顯著。見圖1。

2.3BPA暴露對小鼠肝臟組織TNF-α、IL-1β表達的影響與ND喂養小鼠比，同一時間點HFD喂養小鼠肝臟組織TNF-α和IL-1β表達明顯增強；ND或HFD喂養小鼠中，肝組織TNF-α和IL-1β表達增強呈BPA劑量依賴性，而且12周時較8周時表達更明顯。見圖2、3。

表1 不同劑量BPA暴露ND和HFD喂養小鼠肝臟臟器系數

2.4BPA暴露對小鼠肝臟GSK3α、GSK3α-S21、GSK3β、GSK3β-S9表達的影響與ND喂養小鼠比，HFD喂養同時間點相同BPA劑量暴露小鼠肝組織GSK3β-S9和GSK3α-S21表達降低，差異均有統計學意義(GSK3α-S21：F=6.883，P=0.000；GSK3β-S9：F=50.285，P=0.000)；ND或HFD喂養小鼠中，肝組織GSK3β-S9表達降低呈BPA劑量依賴性，但GSK3α-S21表達無BPA劑量依賴性。ND或HFD喂養小鼠，肝GSK3α和GSK3β表達在各組間差異無統計學意義(GSK3α：F=0.147，P=1.000；GSK3β：F=0.027，P=1.000)。見圖4～8。

圖1 不同劑量BPA暴露ND和HFD喂養小鼠肝組織病理學觀察結果 HE×200

圖2 不同劑量BPA暴露ND和HFD喂養小鼠肝組織TNF-α 表達情況 IHC×200

圖3 不同劑量BPA暴露ND和HFD喂養小鼠肝組織IL-1β表達情況 IHC×200

圖4 不同劑量BPA暴露ND和HFD喂養小鼠肝GSK3α、GSK3α-S21、GSK3β、GSK3β-S9蛋白表達A：8周；B：12周

圖5 BPA暴露對小鼠肝GSK3α蛋白相對表達量影響(n=3)

圖6 BPA暴露對小鼠肝GSK3α-s21蛋白相對表達量影響(n=3)

圖7 BPA暴露對小鼠肝GSK3β 蛋白相對表達量影響(n=3)

圖8 BPA暴露對小鼠肝GSK3β-S9蛋白相對表達量影響(n=3)

3 討論

環境低劑量BPA暴露與肥胖、糖尿病、非酒精性脂肪肝炎等代謝性疾病的關系日益受到關注[9-10]。本研究中小鼠暴露的BPA最高劑量為1 000 nmol/L，以每天飲水量5 ml計算，對應的暴露劑量為22.8 μg/(kg·d)，仍低于歐洲食品安全局和美國國家環境保護局規定的參考劑量50 μg/(kg·d)。結果顯示，此劑量BPA可導致小鼠肝組織病理學改變，出現大泡樣脂肪變性，炎性細胞浸潤增多等損傷。研究[7]表明可控性炎癥在代謝性疾病的發生發展中起著關鍵作用。本研究的結果也顯示肝臟組織中炎性細胞因子TNF-α和IL-1β表達均增加，且隨著BPA劑量的增加而加重，且HFD組比ND組更加明顯。表明低劑量BPA可誘導小鼠肝臟炎癥性損傷，且與HFD具有協同作用，與相關文獻[11-12]報道類似。但BPA與HFD協同作用的具體機制尚不明確。

研究[13]表明GSK3在機體內具有廣泛的底物性，參與炎癥介質如TNF-α、IL-1β、IL-6和胰島素細胞的信號傳導的調控，其絲氨酸殘基(GSK3α-Ser21或GSK3β-Ser9)磷酸化時可抑制其活性，導致下游炎癥細胞因子表達上調，因此被認為是炎癥和自身免疫疾病中潛在的治療靶點[14]。本研究表明，低劑量BPA誘導小鼠肝組織GSK3β-S9和GSK3α-S21表達降低，其中GSK3β-S9表達降低具有BPA劑量依賴性，且HFD組明顯低于ND組，提示低劑量BPA暴露與HFD可共同促進GSK3活化，上調肝臟炎癥因子的表達，導致肝臟炎性損傷。

綜上所述，本研究結果顯示低劑量BPA暴露可導致小鼠肝臟炎性損傷，且與HFD具有協同作用，而GSK3β-S9表達降低導致GSK3活化，進而上調炎癥因子的表達，在其所致肝臟炎性損傷中發揮一定作用。本研究結果為BPA暴露，尤其是與HFD協同誘導肝損傷的發病機制提供基礎資料，可為尋找控制BPA引發肝損傷的潛在靶點提供進一步的實驗依據，對預防和治療BPA暴露誘導的肝損傷及相關代謝綜合征具有重要的理論和現實意義。但低劑量BPA暴露誘導肝損傷中，誘導GSK3β-S9表達降低的具體機制需進一步的深入探討，而環境低劑量BPA暴露人群研究也是今后研究的方向之一。