血清PGⅠ、PGⅡ、miRNA-21、let- 7 a檢測對胃癌的診斷價值

劉紅軍

濮陽市中醫醫院檢驗科，河南濮陽457000

近年來，胃癌的發病率和病死率均有所下降，然而胃癌仍然是發展中國家腫瘤相關死亡的主要原因[1]。盡管晚期胃癌的診斷和治療取得了一定進展，但胃癌患者的預后仍較差，主要原因是早期診斷率低。胃癌早期診斷的生物標志物包括癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖類抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）及糖類抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125），單獨檢測時診斷胃癌的靈敏度和特異度均較低[2]。研究證實，胃蛋白酶原（pepsinogen，PG）Ⅰ、PGⅡ在胃癌的診斷中具有較高的應用價值[3]。微小RNA（microRNA，miRNA）作為癌基因或抑癌基因，在腫瘤的發生、發展過程中具有重要的調控作用。研究表明，miRNA在人類血漿中穩定表達且可檢測，其在正常組織和腫瘤組織中的差異性表達存在組織特異性[4]。let-7a是較早被發現的let-7家族主要成員之一，能夠通過作用于p53、c-myc等靶基因，調控腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡，與腫瘤的轉移及預后密切相關。本研究探討了血清PGⅠ、PGⅡ、miRNA-21、let-7a檢測對胃癌的診斷價值，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2014年1月至2016年6月于濮陽市中醫醫院治療的75例胃癌患者作為研究組。納入標準：①經術后病理證實為胃癌，符合國際抗癌聯盟（Union for International Cancer Control，UICC）第 7版TNM分期標準；②術前未進行放化療治療。排除標準：合并免疫系統、血液系統、內分泌系統疾病。研究組中，男41例，女34例；年齡46～81歲，平均（52.61±8.3）歲；TNM分期：Ⅰ期36例，Ⅱ期12例，Ⅲ期17例，Ⅳ期10例。選取同期健康體檢者60例作為對照組，男32例，女28例；年齡44～79歲，平均（51.23±7.9）歲。兩組受試者的性別和年齡比較，差異均無統計學意義（P﹥0.05），具有可比性。本研究經濮陽市中醫院醫學倫理委員會審批通過，所有受試者均對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標本采集采集所有受試者的清晨空腹外周靜脈血5 ml，置于乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝管中，3000 r/min離心10 min后，分離血清，于-20℃冰箱中保存。

1.2.2 血清PGⅠ、PGⅡ檢測采用美國貝克曼DXI800 Access全自動化學發光分析儀進行血清PGⅠ、PGⅡ測定，嚴格按照說明書進行操作。

1.2.3 miRNA-21、let- 7 a半定量檢測采用實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測受試者的血清miRNA-21和let-7a表達水平。應用RNA提取試劑盒（購自美國sigma-aldrich公司）提取血清總RNA，采用反轉錄試劑盒（購自日本Takara公司）將純化的RNA逆轉錄合成cDNA，以cDNA作為模板進行qRT-PCR。采用ABI 7500 Fast Real-Time PCR系統，分別擴增miRNA-21、let-7a和內參照U6 snRNA，引物均由上海生工生物工程有限公司合成。每個反應設3個重復。qRT-PCR反應條件：95℃30 s（預變性）；95℃15 s，60℃15 s，72℃30 s，共40個循環。擴增結束后確認擴增曲線和溶解曲線，保證得出數據的可靠性。應用2-ΔΔCt法計算miRNA-21、let-7a的相對表達水平。

1.3 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗或方差分析。采用Logistic回歸模型分析早期胃癌發生的影響因素。應用受試者工作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲線及曲線下面積（area under the curve，AUC）評估各血清學指標對胃癌的診斷價值。以P﹤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清PGⅠ、PGⅡ、miRNA-21、let- 7 a水平的比較

兩組受試者的血清PGⅡ水平比較，差異無統計學意義（P﹥0.05）。研究組的血清PGⅠ、let-7a水平及PGⅠ/PGⅡ均明顯低于對照組，血清miRNA-21水平明顯高于對照組，差異均有統計學意義（P﹤0.01）。（表1）

2.2 不同TNM分期胃癌患者血清PGⅠ、PGⅡ、miRNA--21、let-7a水平的比

表1 兩組受試者血清PGⅠ、PGⅡ、miRNA-21、let- 7 a水平的比較（± s）

表1 兩組受試者血清PGⅠ、PGⅡ、miRNA-21、let- 7 a水平的比較（± s）

組別研究組（n=75）對照組（n=60）t值P值PGⅠ（ng/ml）49.44±4.41 105.17±7.71 52.761 0.000 PGⅡ（ng/ml）12.53±2.57 11.83±2.96 1.470 0.144 PGⅠ/PGⅡ3.96±0.67 8.92±1.03 33.739 0.000 miRNA-21 1.83±0.23 0.85±0.14 28.976 0.000 let-7a 0.84±0.06 1.25±0.09 31.643 0.000

不同TNM分期胃癌患者的血清PGⅠ、miRNA-21水平和PGⅠ/PGⅡ比較，差異均有統計學意義（P﹤0.01）。不同TNM分期胃癌患者的血清PGⅡ及let-7a水平比較，差異均無統計學意義（P﹥0.05）。（表2）

2.3 血清PGⅠ、PGⅠ/PGⅡ、miRNA-21、let-7a檢測對胃癌的診斷效能

表2 不同TNM分期胃癌患者血清PGⅠ、PGⅡ、miRNA-21、let- 7 a水平的比較（ n=75，± s）

表2 不同TNM分期胃癌患者血清PGⅠ、PGⅡ、miRNA-21、let- 7 a水平的比較（ n=75，± s）

TNM分期Ⅰ（n=36）Ⅱ（n=12）Ⅲ（n=17）Ⅳ（n=10）F值P值PGⅠ（ng/ml）53.26±4.18 49.06±3.91 45.22±3.20 43.37±5.12 24.043 0.000 PGⅡ（ng/ml）12.53±3.01 12.34±2.74 12.41±2.69 13.06±1.83 0.151 0.929 PGⅠ/PGⅡ4.23±0.71 4.01±0.62 3.71±0.69 3.38±0.65 5.033 0.003 miRNA-21 1.43±0.12 1.59±0.16 2.36±0.22 2.70±0.26 205.114 0.000 let-7a 0.85±0.07 0.84±0.05 0.83±0.08 0.81±0.06 1.002 0.397

PGⅠ診斷胃癌的AUC為0.884，約登指數為0.580，臨界值為70.08 ng/ml，靈敏度為85.41%，特異度為74.26%。PGⅠ/PGⅡ診斷胃癌的AUC為0.786，約登指數為0.547，臨界值為4.13，靈敏度為89.32%，特異度為65.33%。miRNA-21診斷胃癌的AUC為0.803，約登指數為0.623，臨界值為1.16，靈敏度為77.03%，特異度為85.25%。let-7a診斷胃癌AUC為0.805，約登指數為0.627，臨界值為1.12，靈敏度為90.54%，特異度為72.13%。其中PGⅠ對胃癌的診斷效能最高。（圖1）

2.4 血清PGⅠ、PGⅠ/PGⅡ、miRNA-21、let-7a及PGⅠ聯合miRNA-21檢測對早期（Ⅰ～Ⅱ期）胃癌的診斷效能

圖1 血清PGⅠ、PGⅠ/PGⅡ、miRNA-21、let- 7 a診斷胃癌的ROC曲線

PGⅠ、PGⅠ/PGⅡ、miRNA-21、let-7a及PGⅠ聯合miRNA-21診斷早期胃癌的AUC分別為0.883、0.782、0.776、0.780、0.904，其中PGⅠ聯合miRNA-21檢測對早期胃癌的診斷效能最高。（圖2、表3）

2.5 早期胃癌發生影響因素的多因素分析

圖2 血清PGⅠ、PGⅠ/PGⅡ、miRNA-21、let- 7 a及PGⅠ聯合miRNA-21診斷早期胃癌的ROC曲線

表3 血清PGⅠ、PGⅠ/PGⅡ、miRNA-21、let- 7 a及PGⅠ聯合miRNA-21檢測對早期胃癌的診斷效能

Logistic多因素分析結果顯示，血清PGⅠ和miRNA-21是早期胃癌發生的獨立影響因素（OR=1.53、1.43、P﹤0.05）。（表4）

3 討論

表4 早期胃癌發生影響因素的多因素分析

PG是胃黏膜特異性功能酶——胃蛋白酶的無活性前體，是臨床檢測胃部疾病的生物標志物。PG可分為兩種生化和免疫活性不同的亞群：PGⅠ主要由胃底腺細胞分泌，其表達水平變化與胃泌酸腺細胞的功能及胃黏膜腺體的萎縮有關；PGⅡ主要由幽門腺、賁門腺分泌，其表達水平的變化可以反映胃底黏膜病變情況。PGⅠ/PGⅡ下降直接反映胃黏膜萎縮進展[5]。由于分泌PGⅡ的細胞分布較廣，胃癌患者的血清PGⅡ水平變化不明顯，因此，通常采用PGⅠ/PGⅡ評估PG的變化情況，PGⅠ和PGⅠ/PGⅡ聯合檢測可發揮胃底腺黏膜“血清學活檢”的作用。Kalinovski?等[6]研究報道，萎縮性胃炎和胃癌患者的血清PGⅠ水平明顯低于健康者，且低分化胃癌患者的血清PGⅠ水平明顯低于高分化胃癌患者。Miki[7]的研究證實，血清PGⅠ水平和PGⅠ/PGⅡ降低對胃癌的早期診斷具有重要意義。PG不是真正意義上的腫瘤標志物，但其表達水平的變化可以反映胃黏膜的萎縮程度，而萎縮性胃炎是胃癌的癌前病變，PG檢測可篩查出需要做胃鏡檢查的高危人群，因此，血清PG水平變化常作為胃癌前兆的亞臨床指標。本研究發現，胃癌患者的血清PGⅠ水平和PGⅠ/PGⅡ均明顯低于健康體檢者（P﹤0.01），與上述研究報道結果一致。另外，各地文獻報道的PG診斷胃癌及萎縮性胃炎的臨界值不同，導致其診斷的靈敏度和特異度存在差異[8-9]，這可能與檢測方法不同有關，同樣也受病變程度和部位及病理分級不同的影響。本研究結果顯示，血清PGⅠ診斷胃癌的AUC為0.884，最佳臨界值為70.08 ng/ml，靈敏度和特異度分別為85.41%、74.26%；血清PGⅠ/PGⅡ診斷胃癌的AUC為0.786，最佳臨界值為4.13，靈敏度和特異度分別為89.32%、65.33%。王雪華等[10]以PGⅠ74 ng/ml為最佳臨界值，發現其診斷胃癌的靈敏度和特異度分別為85.7%、75.0%，以PGⅠ/PGⅡ4為最佳臨界值，其診斷胃癌的靈敏度和特異度分別為89.0%、62.5%，與本研究結果略有不同，其原因可能與檢測方法不同有關。另有研究發現，血清PGⅠ、PGⅡ水平與性別、年齡及幽門螺桿菌感染等因素均有關[11]。因此，臨床上通常應用PG檢測聯合其他生物學指標診斷胃癌。

miRNA是長度為21～25個核苷酸的非編碼RNA，其通過靶向結合mRNA的3'非翻譯區（3'UTR）抑制轉錄和轉錄后水平的基因表達。miRNA與腫瘤的發生及發展密切相關，在胃液、血漿和血清中的表達水平較為穩定，且在細胞信號轉導通路中具有重要作用，發揮致癌基因或抑癌基因的功能，因此在腫瘤的診斷中具有潛在價值。基于芯片技術和生物信息學方法的研究發現了大量與胃癌有關的miRNA，其中，miRNA-21是發現較早、存在較為廣泛的miRNA，能夠通過作用于Bcl-2、PTEN、caspase 3等多個靶基因，在多種腫瘤中發揮致癌基因的作用[12]。彭寶瑩等[13]研究發現，miRNA-21在胃癌組織中的表達水平明顯高于癌旁正常組織，提示miRNA-21可作為診斷胃癌的有效指標。Cui等[14]研究發現，胃液中的miRNA-21可作為診斷胃癌的潛在生物標志物，具有較高的診斷價值。胡煊等[15]研究表明，胃癌患者血液中miRNA-21的表達水平明顯高于健康體檢者，且與腫瘤浸潤深度、TNM分期、淋巴結轉移等臨床特征有關。本研究結果顯示，胃癌患者血清miRNA-21水平明顯高于健康體檢者（P﹤0.01）；不同TNM分期胃癌患者的血清miRNA-21水平比較，差異有統計學意義（P﹤0.01）。研究表明，let-7a在多種腫瘤組織中的表達下調，是公認的具有抑癌作用的miRNA[16]。Zhang等[17]研究發現，let-7a在胃癌組織中的表達水平明顯低于癌旁正常組織。Tsujiura等[18]研究發現，胃癌患者血清和腫瘤組織中均可檢測到let-7a的表達，且其在胃癌組織中的表達水平明顯低于癌旁正常組織，而胃癌患者的血清let-7a表達水平明顯低于健康體檢者。上述研究表明，let-7a可作為診斷胃癌的腫瘤標志物。本研究結果發現，胃癌患者的血清let-7a水平明顯低于健康體檢者（P﹤0.01），在胃癌中可能作為抑制基因發揮調控作用。

本研究分析血清miRNA-21及let-7a檢測對胃癌的診斷效能，結果發現，血清miRNA-21診斷胃癌的AUC為0.803，靈敏度和特異度分別為77.03%、85.25%；血清let-7a診斷胃癌的AUC為0.805，靈敏度和特異度分別為90.54%、72.13%。結果提示，血清miRNA-21和let-7a診斷胃癌均有較高的應用價值，且miRNA-21的特異度較高，而let-7a的靈敏度較高。本研究結果還顯示，不同TNM分期胃癌患者的血清PGⅠ水平和PGⅠ/PGⅡ比較，差異均有統計學意義（P﹤0.01）。PGⅠ、PGⅠ/PGⅡ、miRNA-21、let-7a以及PGⅠ聯合miRNA-21診斷早期（Ⅰ～Ⅱ期）胃癌的AUC分別為0.883、0.782、0.776、0.780和0.904，其中PGⅠ聯合miRNA-21檢測的診斷效能最高。Logistic回歸分析結果顯示，血清PGⅠ和miRNA-21是早期胃癌發生的獨立影響因素（OR=1.53、1.43，P﹤0.05）。

綜上所述，PGⅠ、PGⅡ、miRNA-21、let-7a等生物標志物在胃癌患者的血清中異常表達，PGⅠ對早期胃癌的診斷效能較高，其與血清miRNA-21聯合檢測可提高早期胃癌的診斷效能。