血清游離miRNA-132及miRNA-301a水平與妊娠期糖尿病相關性研究

明 艷 張祖艷 胡 莉 夏小文 柯曉瓊

湖北省陽新縣婦幼保健院婦產科，湖北陽新 435200

妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）是指妊娠期發生或首次發現的糖耐量異常，但不排除糖類不耐受在妊娠前已存在的疾病，是妊娠期常見并發癥，嚴重危害母嬰健康。近年來，關于GDM的發病機制研究雖已取得較大進展，但仍未完全明確，其中胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是GDM的重要病理機制[1-2]。此外，諸多觀點認為炎癥和免疫異常是胰島素抵抗的重要病因，GDM患者血清及胎盤組織白細胞介素1/6（IL-1/6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、C反應蛋白（CRP）及人白細胞抗原DRB1基因（HLA-DRB1）表達異常[3-6]。微小RNA（micro RNA，miRNA）是一類長度19～24 nt的非編碼單鏈RNA分子，廣泛參與多種良、惡性疾病的發生、發展。近年來，相關研究證實多種miRNA參與2型糖尿病和GDM的發生和進展[7-8]。同時，有研究表明，miRNA-132及miRNA-301a作為促炎性調節因子廣泛參與炎癥、免疫等多種病理生理學進程[9-11]，但尚未見其與GDM相關研究。因此，本研究通過分析GDM和正常孕婦血清游離miRNA-132及miRNA-301a的表達差異，分析其與IR的可能關系，探討miRNA-132及miRNA-301a參與GDM病生理過程及其作為GDM預測和治療靶標的可能。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取于2017年3月～2018年2月在我院產檢并分娩的GDM孕婦30例，作為觀察組（GDM組），隨機選取同期于我院產檢并分娩且無妊娠合并癥的正常孕婦30例為對照組。GDM組納入標準為符合2013年世界衛生組織GDM診斷標準[11]。排除標準：合并免疫系統性疾病、傳染性疾病、慢性肝腎功能損傷性疾病、心臟病、孕前有糖尿病史或有糖尿病家族史、既往有高血壓或高血脂等代謝性疾病。本研究通過醫院醫學倫理委員會批準，患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 實驗室檢查 受試者于孕24～28周時清晨且空腹8h后抽取肘靜脈血，采用全自動電化學發光分析儀（Cobase41）檢測血糖相關實驗室指標，包括：空腹血糖（FPG）及空腹胰島素（FINS），檢測試劑盒購自德國羅氏公司；采用酶聯免疫吸附試驗檢測血清炎癥因子水平，包括：IL-1，IL-6，IL-10，TNF-α及CRP水平，試劑盒購自杭州碧云天公司，酶標儀購自美國RD公司（Phomo型）。胰島功能采用HOMA模型胰島素抵抗指數（homeostatic model assessment insulin resistant，HOMA-IR）進行評價，HOMA-IR=FPG×FINS/22.5，剩余血清凍存于-80℃用于miRNA-132及miRNA-301a檢測。

1.2.2 血清游離RNA提取 采用Trizol 試劑盒（日本Takara公司）提取總RNA，所有步驟均按試劑盒說明操作：加入Trizol充分混勻后靜置，采用苯酚/氯仿去蛋白處理，乙醇沉淀并清洗RNA后加入焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶解RNA，利用紫外-可見分光光度計進行純度檢測。

1.2.3 血清游離miRNA檢測 取2μg總RNA為模板，采用逆轉錄試劑盒（日本Takara公司）將RNA逆轉錄為cDNA，并采用TaqMan miRNA檢測試劑盒（日本Takara公司）進行q-PCR，每個檢測樣本設3個復孔，以U6位內參照。PCR引物均由上海生工生物公司合成，miRNA-132：5'-CCAGCATAACAGTCTACAGCCA-3'，5'-TATGGTTGTTCACGACTCCTTCAC-3'；miRNA-301a：5′-ACACTCCAGCTGGGCAGTGCAATAGTA TTGTC-3′，5′ -CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′ ；U6：5 ′ -GCT-TCG-GCA-GCA-CAT-ATA-CTAAAA-T--3′，5′ -CGC-TTC-ACG-AAT-TTGCGT-GTC-AT-3′。miRNA表達量以2-ΔCt表示，其中ΔCt=CtmiRNA-CtU6。

1.3 觀察指標

對比分析兩組研究對象年齡，BMI，胰島素抵抗相關實驗室指標FPG和FINS，血清炎癥相關因子以及血清游離miRNA-132及miRNA-301a水平，并采用HOMA-IR計算胰島素抵抗指數。其中FPG和FINS是評判GDM的直接指標，將FPG和FINS數值采用HOMA模型計算可以得到間接反映胰島素抵抗指數HOMA-IR，其值越大說明胰島素抵抗越嚴重。血清炎癥因子包括促炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α、CRP以及抗炎因子IL-10。

1.4 統計學處理

采用SPSS19.0統計學軟件進行數據分析，計量資料以（±s）表示，采用t檢驗。采用單直線相關性分析方法分析與血清miRNA-301a及miRNA-132水平相關的因素，r值為正數表示成正相關關系，r值為負數表示成負相關關系。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者一般資料及實驗室指標比較

兩組研究對象之間年齡比較差異無統計學意義（P＞0.05）；GDM組孕婦BMI及HOMA-IR指數均高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；此外，GDM 組孕婦血清中 FPG、FINS、IL-1、IL-6、TNF-α及CRP水平均明顯高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），而血清IL-10水平低于對照組孕婦，差異有統計學意義（P＜0.05），見表l。

表1 兩組對象一般資料及實驗室指標比較（±s）

表1 兩組對象一般資料及實驗室指標比較（±s）

注：BMI：體質指數；FPG：空腹血糖；FINS：空腹胰島素；HOMA-IR：胰島素抵抗指數；IL-1：白介素1；IL-6：白介素6；IL-10：白介素10；TNF-α：腫瘤壞死因子α；CRP：C型反應蛋白

組別 年齡（歲）CRP（g/L）GDM組（n=30） 26.34±7.52 24.98±4.35 6.86±0.93 13.98±1.89 4.26±1.92 190.03±10.33 108.36±7.84 21.86±2.74 12.03±2.58 6.89±1.58正常組（n=30） 26.05±5.93 22.31±3.43 4.35±0.67 9.69±1.63 1.87±1.32 99.67±6.47 62.75±7.03 36.01±3.13 6.19±1.64 3.89±0.87 t 0.166 2.640 11.990 9.415 5.618 40.600 23.720 18.630 10.460 9.110 P 0.869 0.011 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 BMI（kg/m2）FBG（mmol/L） （mIU/L） HOMA-IR L-1（ng/L）FINS IL-6（ng/L）IL-10（ng/L）TNF-α（μg/L）

2.2 兩組產婦血清游離miRNA-132及-301a表達水平比較

GDM組孕婦的血清游離miRNA-301a表達水平明顯高于正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），而miRNA-132水平雖稍高于正常對照組，但差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 兩組產婦血清游離miRNA-132及miRNA-301a表達水平（±s）

表2 兩組產婦血清游離miRNA-132及miRNA-301a表達水平（±s）

組別 n miRNA-132 miRNA-301a GDM組 30 0.474±0.038 0.266±0.067正常組 30 0.215±0.041 0.239±0.073 t 25.380 1.492 P 0.000 0.141

2.3 miRNA-132及miRNA-301a表達相關因素分析

采用單直線相關分析方法分析各觀察項目與血清游離miRNA-132及-301a表達水平的相關性，結果表明，血清miRNA-301a水平與年齡、BMI無明顯相關性（P＞0.05），而與血清FBG、FINS、IL-1、IL-6、TNF-α 及 CRP水平和 HOMA-IR 指數 呈 正 相 關（r=0.2614、0.3538、0.5025、0.3017、0.1947、0.1435、0.5439，均 P ＜ 0.05），與血清 IL-10水平呈負相關（r=-0.1856，P＜0.05）；而血清游離miRNA-132水平與觀察項目均無明顯相關性（P＞ 0.05）。見表3。

表3 各項目與血清游離miRNA-132及miRNA-301a水平的相關性分析

3 討論

炎癥與妊娠期糖尿?。℅DM）的發展密切相關，炎癥失調的證據（即促炎和抗炎介質失衡）最早可以在妊娠早期被發現，而后進展為GDM。GDM患者體內促炎和抗炎介質失衡多由自身免疫失調所引起，也是GDM胰島素抵抗的重要病理機制之一[3]。隨著基因檢測技術的推廣，近年來miRNA在GDM發病中的作用和機制研究逐漸成為GDM研究的熱點之一。本研究通過分析GDM和正常孕婦血清游離miRNA-132及miRNA-301a的表達差異，分析其與IR和炎癥因子失衡的可能關系，探討miRNA-132及miRNA-301a水平與GDM之間的可能關系。

在正常妊娠期間，T輔助細胞的平衡從促炎性Th1（其中細胞產生的促炎因子IL-1、IL-2、IL-6、干擾素γ、TNF和CRP等）轉變為抗炎性Th2（其中抗炎因子IL-10、IL-4、IL-5和IL-13等占主導地位），它們在母體各器官機能穩定及母胎關系中具有保護作用[3，12]。當體內自身免疫紊亂時，通過導致保護性抗炎因子水平低于促炎因子水平從而導致促炎和抗炎介質失衡，從而引發胰島β細胞功能紊亂，最終導致胰島素抵抗。而本研究中也證實GDM組孕婦血清促炎因子水平明顯高于正常組，而抗炎因子則明顯低于正常對照組，這也與其他相關研究結果一致。

近年來，有學者證實miRNA-132及-301a的表達升高與機體炎癥及免疫反應存在聯系[9-10]，miRNA-132及miRNA-301a升高可引起促炎因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α及COX2等水平升高，引起機體抗炎-促炎介質失衡，導致相關器官結構和功能損害，而其作用可能通過NF-κB或STAT3信號通路實現[9，13]，且這些通路都與GDM的發生、發展密切相關[14-17]。而抑制miRNA-132及miRNA-301a的表達可明顯緩解機體炎癥紊亂狀態[9，12]。 此 外，miRNA-132 及 miRNA-301a還 與機體免疫調節相關[18-19]。而在本研究中，GDM組孕婦miRNA-301a水平明顯增高，同時伴有促炎因子水平升高及抗炎因子水平降低，且血清游離miRNA-301a水平與促炎因子水平及胰島素抵抗指數呈正相關，而與抗炎因子水平呈負相關，因此我們推測，miRNA301a水平增加引起促炎癥因子水平上升，使T輔助細胞的平衡從促炎性Th1向抗炎性Th2轉換受阻，導致胰島β細胞功能損害而發生胰島素抵抗。此外，miRNA-132主要通過抑制沉默信息調節因子1（silent information regulation 2 homolog 1，SIRT1）發揮促炎作用[20]，而GDM患者血清SIRT1水平較正常者升高，且SIRT1對GDM的發生發展具有雙重調節作用[21-24]，這可能是GDM患者血清miRNA132水平與正常對照組無統計學差異的可能原因，仍有待相關機制研究進行證實。

綜上所述，GDM患者機體抗炎-促炎介質失衡，血清游離miRNA-301a水平與GDM發病密切相關，其可能通過引起機體炎癥調節紊亂從而導致胰島素抵抗發生，可作為GDM重要的預測指標和治療靶點，而血清miRNA132水平與GDM無明顯相關性。本研究不足之處在于樣本量較小，且只檢測了血清游離miRNA水平，因此，本研究實驗結論及其具體機制仍有待進一步的大樣本及深層次的研究予以證實。