高效氯氰菊酯對中華絨螯60 d慢性毒理及病理研究

張悅，吳晟旻，張曉君，陳輝，方蘋，王晶晶

(1. 揚州大學動物科學與技術學院，江蘇 揚州 225000；2. 南京環境科學研究所環境保護部 江蘇 南京 210000；3. 江蘇省漁業技術推廣中心，江蘇 南京 210000)

高效氯氰菊酯，化學名為2，2-二甲基-3-(2，2-二氯乙烯基)環丙烷羧酸-α-氰基- (3-苯氧基)芐酯，戊酸氰醚酯，屬于擬除蟲菊酯農藥殺蟲劑[1]，用來殺滅農作物害蟲，預防魚類寄生蟲疾病[2]。由于其具有廣譜性、低毒性和高效性，因此在全國的養殖區域大規模使用[3]。擬除蟲菊酯不僅會對引起水生動物中毒病死，還會對生態環境造成污染[4]。

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)屬節肢動物門，軟甲綱，十足目，爬行亞目，方蟹科，絨螯蟹屬，是一種經濟蟹類，又稱河蟹，毛蟹，清水蟹，大閘蟹，是我國淡水養殖的重要品種之一[5]。隨著河蟹養殖地域范圍越來越大，養殖產量逐年上升，養殖模式不斷變化，河蟹病害問題日趨嚴重[6]。近年來，多地區暴發河蟹肝胰腺病變綜合征(俗稱“水癟子”病)，對河蟹養殖業造成了嚴重的損失[7]。2015—2016年，在江蘇興化地區大面積暴發河蟹肝胰腺病變綜合征，3—4月開始大量出現病癥，5—8月上旬達到該病高發期，塘口發病率為30%～40%，嚴重的高達90%～100%。高溫期過后，病死率逐漸下降直至達到平穩甚至恢復的狀態[8]。經調查發現興化地區養殖池塘普遍存在潑灑化學農藥氯氰菊酯殺毒的現象[9]，推測氯氰菊酯可能會造成中華絨螯蟹的肝胰腺病變。該實驗探究在相同環境條件下不同濃度的高效氯氰菊酯對中華絨螯蟹扣蟹體質量和存活率的影響，并通過石蠟切片，設置3個梯度濃度探究氯氰菊酯對河蟹組織影響。

1 材料與方法

1.1 扣蟹

試驗于2017年6月在南京環境科學研究所國家環境保護農藥環境評價與污染控制重點實驗室進行，試驗用中華絨螯蟹扣蟹由江蘇省漁業技術推廣中心提供。扣蟹在試驗前暫養1周以上。保持每天光照14 h，溫度22.9～23.2 ℃，pH值7.71～7.82，溶解氧大于飽和度的80%，每天投食2次，至試驗開始前24 h為止。餌料主要成分：粗蛋白 > 30.0%、粗脂肪 > 2.0%、粗纖維 <3.0%、灰分 < 12.0%、水分 < 10.0%。

在馴養環境中適應48 h后，7 d馴養期內受試扣蟹病死率為0，因此該批扣蟹(批號：F20170615K)符合試驗用扣蟹要求。試驗開始時，扣蟹的平均體質量為5.949 g，相對標準偏差2.14%。

1.2 試驗用水

試驗用水為曝氣處理24 h以上的自來水，水質硬度為145 mg/L(以CaCO3計)，pH值7.20。

1.3 試驗試劑和儀器設備

水質參數測定儀；分析天平；20 L玻璃缸；水浴槽；手動單道移液器；氯氰菊酯原藥；蠟塊；蘇木精-伊紅染料；無水乙醇。

1.4 受試濃度的選擇

根據扣蟹急性毒性試驗結果，受試物對扣蟹96 h-LC50=0.612 mg/L。因此，60 d延長毒性試驗設置配制濃度為0.01、0.10、1.00 mg/L3個受試物處理組，同時設置不含受試物的空白對照組和溶劑對照。

1.5 受試物溶液的制備

試驗時，準確稱取1.0531 g高效氯氰菊酯(純度95%)，用乙腈溶解并定容至100 mL，得到10 000 mg/L的受試儲備液。將受試物貯備液置于4 ℃冰箱貯存，試驗期間每隔3 d重新配制儲備液。

試驗時，準確吸取適量受試物貯備液加入試驗用水中，機械攪拌30 min后配制成一定濃度的受試物溶液。受試物溶液每隔24 h更新。試驗期間，測試容器始終加蓋。具體配制方法見表1。

表1 受試物溶液的配置方法

1.6 暴露條件

在該試驗條件下，受試物比較穩定，因此試驗采用半靜態法(換水頻率為24 h)。試驗期間，各項試驗條件控制如下。

暴露時間：60 d；暴露溶液體積：2 L；承載量：5.0～7.0 g/L(拭干體表水分后的濕重)；暴露密度：20只/缸；光照：每天14 h光照；溫度：23.0～23.1 ℃；溶解氧濃度：飽和度的85%～97%，試驗期間不曝氣；飼喂：每天喂食，飼喂量為扣蟹體初始體質量的2%；清潔：每次更新溶液的同時清理玻璃缸。

1.7 觀察

每天觀察和記錄受試扣蟹的死亡情況，當觀測到扣蟹沒有呼吸運動或觸碰無反應，即判定扣蟹已病死。每天觀察和記錄其他非致死效應，包括與對照組扣蟹明顯不同的體外特征和行為。

1.8 測定

試驗開始前逐條測量體質量。試驗結束后逐條測量存活扣蟹體質量。試驗過程中不進行任何受試扣蟹體質量的測量。在0、7、14、28、54、60 d測定受試溶液的溶解氧含量、pH值和溫度。

1.9 病理組織切片的制備

在 96 h-LC50 的0.10 μg/L，0.19 μg/L，0.59 μg/L濃度脅迫第 15天，再分別從3個濃度組隨機取出3 只河蟹，迅速取出肝胰腺用Bouin氏液固定24 h，固定樣品經 70%、80%、95%、100%梯度酒精脫水， 二甲苯透明，常規石蠟包埋。使用手搖式切片機切片( 厚度約 5μμm)， HE( 蘇木精-伊紅)染色，Olympus顯微鏡觀察、拍片。

1.10 數據處理

采用Bartlett’s tests(ANOVA，STATA 10.0)多元對比分析受試組扣蟹的假定比增長率，確定最低顯著效應濃度(LOEC)(P<0.05)與無顯著效應濃度(NOEC)。

2 結果與分析

2.1 試驗條件

試驗期間，試驗條件測定結果見表到2、表3和圖1。結果表明：試驗期間，空白對照組和受試組溶液pH值在7.65～7.83范圍內，溶解氧保持在飽和溶解氧的85%～97%之間，溫度控制在23.0～23.1 ℃，保證試驗只有氯氰菊酯濃度不同這一個變量，其他條件相同。

2.2 試驗有效性

2.2.1 對照組試驗 與受試物處理組相同的試驗條件下，同時開展試驗用水空白和溶劑對照試驗。試驗結束時，空白對照組和溶劑對照組受試扣蟹活動正常、無病死。

2.2.2 受試扣蟹承載量 單位水體載魚量為5.0～7.0 g(拭干體表水分后的濕重)/L。

2.2.3 試驗有效性 試驗期間，空白對照組和受試組溶液pH值在7.65～7.83范圍內，溶解氧保持在飽和溶解氧的85%～97%之間，溫度控制在23.0～23.1 ℃。空白對照組和溶劑對照組受試扣蟹活動正常。試驗期間，受試物濃度保持恒定，因此各項試驗條件滿足試驗有效性標準(溶解氧：不低于空氣飽和濃度的60%；空白對照組受試扣蟹病死率不超過10%)。

2.3 病死率與危害影響

表3為在不同濃度作用下，扣蟹病死率及異常情況，表4為扣蟹60 d體質量前后變化表。圖1為在不同濃度作用下，扣蟹存活率情況折線圖。

表2 扣蟹病死率及異常情況

表3 扣蟹60 d體質量前后變化表

圖1 不同濃度的氯氰菊酯對中華絨螯蟹扣蟹60 d存活情況

試驗結果表明，中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)扣蟹在高效氯氰菊酯(0.10、1.00 mg/L處理組)作用下攝食量逐漸減少，剩餌增多，由表4可以看出在高效氯氰菊酯作用下中華絨螯蟹體質量明顯降低。尤其是 1.00 mg/L濃度組最明顯。0.01 mg/L處理組和對照組扣蟹無明顯異常現象。

2.4 氯氰菊酯對中華絨螯蟹各組織結構的影響

組織切片觀察發現，3個氯氰菊酯濃度下，中華絨螯蟹各組織結構均發生了一定的變化。尤其是中華絨螯蟹肝胰腺組織最明顯，正常狀態下河蟹的肝小管結構完整，上皮細胞排列整齊，無空泡現象的發生。0.10 μg/L低濃度下，輕微出現空泡，肝小管基膜增厚。0.19 μg/L濃度下，肝小管間的血細胞數量增多，空泡數量增多，基膜破裂，部分肝小管發生水腫、變性，細胞結構模糊。在0.59 μg/L濃度下，出現大面積的空泡化結構，細胞排列出現紊亂，發生壞死解體，細胞核固縮、破碎，使官腔內出現許多細胞碎片[10-13]。

圖2 0.10 μg/L氯氰菊酯濃度下河蟹肝胰腺組織病理切片

圖3 0.19 μg/L氯氰菊酯濃度下河蟹肝胰腺組織病理切片

圖4 0.59 μg/L氯氰菊酯濃度下河蟹肝胰腺組織病理切片

圖5 氯氰菊酯作用下河蟹鰓組織病理切片

高效氯氰菊酯除了引起中華絨螯蟹的肝胰腺損傷，還會對肌肉、鰓組織有一定破壞。如圖5、圖6，正常的中華絨螯蟹鰓呈現干凈無污物，上皮細胞排列整齊。而如圖5受到高效氯氰菊酯作用的中華絨螯蟹的鰓葉間出現大量雜質，上皮細胞發生崩解。

中華絨螯蟹的附肢肌肉為橫紋肌，健康蟹的附肢肌細胞核呈圓形或梭形，位于細胞的邊緣，肌纖維排列整齊，橫紋清晰，纖維間的肌質網密集。在氯氰菊酯作用下，部分肌肉橫紋肌發生模糊，肌纖維發生萎縮，肌纖維間和肌束間水腫而間隙增大，尤其肌束膜與肌束間的分離更為明顯。

圖6 氯氰菊酯作用下河蟹肌肉組織病理切片

3 結論

在有效半靜態法[14](換水頻率24 h)試驗條件下，60 d試驗期間，受試物對中華絨螯蟹扣蟹60天最低可觀察效應濃度(LOEC)和無可觀測效應濃度(NOEC)，具體如下：60d-NOEC(體質量)=0.01 mg/L；60d-LOEC(體質量)> 0.01 mg/L。

試驗結果表明，采用Bartlett’s tests(ANOVA，STATA 10.0)將每個濃度組的體質量與對照組比較的結果顯示，受試物處理組(0.01 mg/L)體質量與空白對照組相比差異不具統計學意義(P>0.05)， 受試物處理組(0.10， 1.00 mg/L)體質量與空白對照組相比差異具統計學意義(P<0.05)。

中華絨螯蟹是典型的甲殼動物，在一生中要經歷多次蛻殼。在60 d試驗期間，觀察到受試扣蟹至少蛻殼一次。在蛻殼過程中，蟹體大量吸收水分，體質量增加明顯，而在蛻殼后的生長中，體質量增長緩慢，水分逐漸為組織生長所代替，生長不連續而呈跳躍式的特點。剛蛻殼的受試扣蟹對高效氯氰菊酯十分敏感，特別是0.10、1.00 mg/L處理組剛蛻殼螃蟹病死率明顯增加，在1.00 mg/L濃度組最明顯，而0.01 mg/L處理組和對照組扣蟹無明顯異常現象。

一定濃度的氯氰菊酯會對河蟹的肝胰腺、鰓和肌肉組織產生明顯的病理變化。且在不同的濃度下，呈現不同的病變狀態，濃度越高對中華絨螯蟹組織破壞力越強。