新型DNA-AgNCs在谷胱甘肽臨床體外診斷中的應用研究

夏海娜 邵偉

【摘要】 目的：以DNA為模板制備的水溶性銀納米簇（AgNCs）具有合成簡單性質溫和的特點，為拓展其在臨床體外診斷中的應用，開展本次研究。方法：從四種緩沖液和三種DNA合成模板中篩選出最佳合成方案，制備具有良好熒光特性的DNA-AgNCs，并利用其對GSH和GGSH進行快速靈敏的體外檢測，驗證其在體外診斷中所發揮的作用。結果：合成的DNA-AgNCs熒光特性穩定，熒光光譜性質穩定，對GSH的檢測具有很強的特異性，在0～10 μmol/L的范圍內DNA-AgNCs的熒光強度與GSH的濃度成反比。結論：本研究為DNA-AgNCs在體外診斷中的應用帶來了新的思路，拓展了其應用領域，其優異的熒光特性具有廣闊的應用前景。

【關鍵詞】 銀納米簇 DNA 體外診斷熒光

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.28.028 文獻標識碼 B 文章編號 1674-6805（2019）28-00-03

Application of Novel DNA-AgNCs in the Clinical Diagnosis of Glutathione in Vitro/XIA Haina， SHAO Wei. //Chinese and Foreign Medical Research， 2019， 17（28）： -70

[Abstract] Objective： To explore the role that AgNCs can play in clinical in vitro diagnosis， and show the characteristics of simple synthesis and mildness that water-solubled silver nanoclusters （AgNCs） prepared by DNA template had， we conducted this study. Method： Selected the best synthesis scheme from four buffer solutions and three DNA synthesis templates， prepared DNA-AgNCs with good fluorescence characteristics， and used it for rapid and sensitive in vitro detection of GSH and GGSH to verify its role in vitro diagnosis. Result： The DNA-AgNCs had stable fluorescence characteristics and stable fluorescence spectra. The detection of GSH was highly specific， and the fluorescence intensity of DNA-AgNCs was inversely proportional to the concentration of GSH in the range of 0-10 μmol/L. Conclusion： Our study provides a new idea for the application of DNA-AgNCs in vitro diagnosis， expanded its application field， and its excellent fluorescence characteristics have broad application prospects.

[Key words] AgNCs DNA IVD Fluorescence

First-authors address： Putuo District Peoples Hospital in Zhoushan City， Zhoushan 316100， China

銀納米簇（sliver nanoclusters，AgNCs）是由幾個到十幾個銀原子組成的納米分子級聚集體，其往往是由有機配體或生物相容性材料作為穩定基團包裹形成的[1-2]。AgNCs與其他熒光金屬納米簇的一樣，具有熒光強度高、抗光漂白性強、量子產率高、熒光波長可調[3]、生物毒性低等優點[4]，近年來在生物檢測[5]、體外診斷、熒光示蹤和細胞成像分析等領域受到了越來越廣泛的關注[6]。谷胱甘肽是一種由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的具有重要生理功能的天然活性肽，在體內有還原型和氧化性兩種形態。還原型谷胱甘肽（glutathione reduced，GSH），具有清除自由基、解毒、保護肝臟、提高免疫力及抗癌等諸多作用，其半胱氨酸上的巰基是發揮其生物學功能所不可缺少的功能基團。谷胱甘肽的檢測可以為病毒性肝炎、腦類疾病、免疫系統疾病等的診斷提供依據[7]。本研究首先探索了AgNCs的合成，由于溫和地制備水溶性AgNCs并不容易，筆者選擇以DNA為合成模板，并篩選了最佳的性質溫和的緩沖體系，研究合成后的DNA-AgNCs作為體外診斷試劑在檢測GSH中所發揮的作用。

1 材料與方法

1.1 一般材料

（1）硝酸銀（AgNO3）（購于Sigma公司）;（2）醋酸銨（CH3COONH4，NH4Ac）（購于Sigma公司）;（3）脫氧核糖核酸（DNA）模板鏈（購于Sangon上海分公司，經PAGE純化），DNA1：5-TTCCCACCCACCCCGGCCCGTT-3;DNA2：5-TATCCGTCCCCCACGGATA-3;DNA3：5-GCAGTTGATCCTTTGGATACCCTGG-3;（4）硼氫化鈉（NaBH）（購于aladdin公司）;（5）磷酸二氫鈉（NaH2PO4）（購于Sigma公司）;（6）磷酸二氫鉀（KH2PO4）（購于Sigma公司）;（7）磷酸氫二鈉（Na2HPO4）（購于Sigma公司）;（8）氯化鉀（KCl）（購于Sigma公司）;（9）氯化鈉（NaCl）（購于Sigma公司）;（10）GSH（購于Sigma公司）;（11）氧化型谷胱甘肽（Glutathione oxidized，GSSG）（購于Sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 DNA-AgNCs的合成 4個不同的DNA合成組（1～4號分別為H2O對照組、DNA1模板組、DNA2模板組、DNA3模板組）分別加入H2O、PBS、低濃度NH4Ac（10 mmol/L NH4Ac）、高濃度NH4Ac（80 mmol/L NH4Ac）四種不同的緩沖體系中，再向體系中加入AgNO3溶液，三者充分混勻后放置于4 ℃冰箱中孵育20 min。隨后向反應體系中加入NaBH4混勻，放置于4 ℃冰箱中反應1 h。反應完成后取樣品測定其熒光強度，剩余樣品在凝膠成像儀中拍照，隨后放入冰箱中保存。

1.2.2 熒光檢測方法 實驗中，銀納米簇的熒光光譜用F7000熒光光譜儀檢測，光譜儀的檢測參數設置為：激發光波長570 nm，激發光光柵為2.5 nm，發射光范圍580～800 nm，發射光接收光柵為2.5 nm，激發光電壓為900 V。

1.2.3 GSH的檢測 取DNA-AgNCs與不同濃度的GSH和GSSG水溶液等體積混合，混勻后將反應體系避光靜置5 min，測定其熒光光譜。

2 結果

本研究選擇了一種耗時較短的合成方法，按緩沖體系的不同分為四組，通過凝膠成像儀拍攝的結果圖1中可以看出，在10 mmol/L NH4Ac（圖1A）、H2O（圖1B）、pH 7.0 10 mmol/L PBS（圖1C）、80 mmol/L NH4Ac（圖1D）四種緩沖體系中，1～4號EP管中分別加入H2O（對照）及DNA1、DNA2、DNA3三種合成模板，在四組中均都只有加入DNA1的2號管中合成了具有熒光特性的DNA-AgNCs，因此，DNA1是研究所選的合成條件下，最佳的合成模板。

從圖1中還可以看出，在不同緩沖條件下，合成產物的熒光強度（亮度）有明顯的不同，B、C兩組熒光強度明顯弱于A、D兩組，但是較難區別A、D兩組合成產物的熒光強度差異，因此研究選擇通過熒光光譜檢測區分二者的差異。最終結果顯示A組緩沖體系合成的DNA-AgNCs熒光強度更高，最佳合成方案為在10 mmol/L NH4Ac中利用DNA1為模板合成DNA-AgNCs。

通過一系列驗證，最終選擇A組緩沖中，利用DNA2為模板合成DNA-AgNCs，并且在合成后，用熒光光譜儀對其熒光特性做了熒光光譜表征，合成的DNA-AgNCs激發光波長為570 nm，發射光波長為630 nm。峰值不會隨激發光的改變而偏移，合成產物熒光強度穩定，熒光效率強（圖2）。

本研究隨后利用合成的DNA-AgNCs對GSH進行了檢測，因為GSH和GSSG在人體中是共同存在的，因此檢測體系需要對二者進行區別（圖3），從圖中可以看出在0～10 μmol/L時GSSG對DNA-AgNCs的熒光強度幾乎沒有影響，GSH在人體血液中的含量約為371 mg/L，GSSG約為3.71 mg/L（約為6.05 μmol/L），通過圖3的結果可以看出，在對實際樣本檢測時GSSG的存在不會對GSH的檢測產生影響，因此，利用合成的DNA-AgNCs對GSH的檢測是具有特異性的。

3 討論

光學納米探針在疾病治療、生物學成像、光學示蹤和體外診斷等方面現在發揮了越來越大的作用[8-9]，金屬熒光納米簇由于具有特殊的光電學性質，近年來在體外診斷和影像學分析領域受到廣泛的關注和研究，金銀納米簇是金屬納米簇中獲得最多關注的研究對象。相比于金納米簇，銀納米簇的應用研究，尚處于開始階段，由于其具有合成簡單、熒光量子產率高、熒光發射波長可調等優點，已經成為金屬熒光納米簇領域里具有良好發展前景的材料之一，在體外診斷、檢測分析、熒光成像和示蹤、生物標記等應用領域被廣泛研究。

與金納米簇相比，在性質溫和的水溶液中合成具有穩定熒光性質的銀納米簇相對要困難得多，這是由于在水溶液中AgNCs、自身趨向于團聚，使得新合成的AgNCs的體積會持續增長，從而變成大尺寸的納米顆粒，喪失熒光特性。因此，在AgNCs合成中，需要降低表面能量，阻止其持續性增長，就需要選擇與Ag/Ag+親和力強的模板或抑制劑來合成，目前常用的模板分子有很多，比如，聚合物（聚乙烯亞胺、聚乙烯吡咯烷酮、聚酰胺-胺樹狀分子等）、DNA、多肽和蛋白等[10]。從2004年Petty等[11]首次以DNA為模板制備了穩定性好、可溶于水的、熒光性質穩定的AgNCs，此后，越來越多文獻報道DNA-AgNCs的合成及其應用。由于DNA模板可以靈活設計，合成簡單快速，逐漸成為最受歡迎的AgNCs合成模板，隨著研究工作的不斷展開，研究人員發現DNA模板的長度和序列能夠調控合成后的DNA-AgNCs的光學性質，能夠產生穩定的光學差異，發射不同波長的熒光[12]。

目前，DNA-AgNCs主要在疾病標志物診斷和熒光顯影中進行應用研究，其中絕大部分都是利用其熒光的淬滅或增強檢測離子等小分子、利用DNA的堿基互補配對特性來檢測特定的DNA序列/單堿基突變或與DNA有關酶類的檢測[13-15]。

本研究利用合成的新型DNA-AgNCs用于檢測生物活性小分子GSH，該分子是在1929年由Hopkins發現并命名的[7]，在生物體中有兩種存在形式，GSH和GSSG，二者在正常人體內的比例大約為100∶1。通常所常指的谷胱甘肽是GSH，具有清除自由基、解毒、保護肝臟、提高免疫力及抗癌等諸多作用，谷胱甘肽的檢測可以為病毒性肝炎、腦類疾病、免疫系統疾病等的診斷提供依據。

通過研究結果可以發現，筆者合成的DNA-AgNCs的熒光性質穩定，熒光強度高，在GSH的檢測中表現出了良好的特異性，能夠作為GSH體外檢測疾病診斷的檢測試劑，同時，通過結果筆者還發現，DNA-AgNCs的合成對DNA模板和緩沖體系都有一定要求，這對今后探討合成產物在熒光成像中的應用提供了基礎，值得進一步研究。

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（收稿日期：2019-05-05） （本文編輯：郎序瑩）