β-羥丁酸對腦膠質瘤細胞增生糖酵解的影響

于春娜 江 波 李文斌* 陳 峰

(1.首都醫科大學附屬北京天壇醫院神經腫瘤綜合治療科，北京 100050；2.首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院胃腸外科/臨床營養科，北京 100038)

腦膠質瘤是一種起源于中樞神經系統的惡性腫瘤，其惡性程度高，侵襲性強，患者生存期短。目前，腦膠質瘤標準治療包括最大限度的手術切除，繼而輔以放射治療及替莫唑胺化學藥物治療。但由于腫瘤組織的浸潤特性，無法完全切除，殘存的腫瘤細胞常常成為復發的來源[1]。盡管在接受了全面地治療后，膠質母細胞瘤(glioblastoma，GBM)患者的平均生存期也僅有12～15個月。標準治療雖然在短期內控制了膠質瘤地生長，但卻可以促進并加快腫瘤的復發[2]。因此，尋找新的治療方法迫在眉睫。

能量代謝改變是腫瘤細胞的特征之一，即表現為無論在有氧或無氧環境下，腫瘤細胞均以葡萄糖酵解作為能量供應方式，這種現象被稱為“沃伯格”效應[3]。因此，理論上可以通過限制葡萄糖攝入，選擇性饑餓腫瘤細胞，從而達到限制腫瘤細胞生長的目的。生酮飲食(ketogenic diet，KD)是一種高脂肪(60%～90%)、低碳水化合物(2%～5%)及適量蛋白質的飲食方式，已在治療兒童難治性癲癇領域應用了數十年[4]。KD提供的脂肪和蛋白質可以滿足人體正常組織的基本能量代謝需求，但卻降低了體內血糖濃度，減少了腫瘤細胞能量供應從而達到抑制腫瘤細胞生長的目的。不僅如此，KD還能發揮抗氧化、抑制炎性反應及增強免疫的作用[5-6]。早在1995年，Nebeling等[7]就嘗試將KD應用于惡性神經膠質瘤的治療，并取得一定治療效果。2010年，Zuccoli等[8]報道了1例膠質母細胞瘤的患者經過生酮飲食聯合標準療法治療后，腫瘤病灶消失，停止生酮飲食10周后腫瘤復發。之后的研究[9]顯示，KD可以延長腦膠質瘤患者生存期、改善預后并提高放射治療及化學藥物治療敏感性。

KD的核心是高脂肪及低碳水化合物，脂肪通過肝臟進行β-氧化，生成β-羥丁酸(β-hydroxybutyrate，β-HB)、乙酰乙酸(acetoacetate)以及丙酮(acetone)3種酮體，其中β-HB約占酮體總量的70%[10]。酮體作為除葡萄糖外的另一種供能物質，被運輸到肝臟之外的組織中產能。除了減少腫瘤的能量來源，KD的抗腫瘤作用部分歸功于產生的酮體。使用生理劑量的β-HB可以抑制人和鼠膠質母細胞瘤細胞系的增生[11]。此外，β-HB增加了放射治療和化學藥物治療藥物對人膠質母細胞瘤細胞系的治療效果[11-12]。雖然KD在荷瘤動物實驗[7-12]中被證明有不錯治療效果，但對β-HB的研究多集中于其抗炎、抗氧化及神經保護作用，對腦膠質瘤細胞代謝影響的報道較少。因此，基于腫瘤細胞的“沃伯格”效應，在本研究中探討了KD代謝產物β-HB對腦膠質瘤細胞生長及糖酵解的影響，進一步闡釋KD抗腫瘤的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑

實驗使用的人腦膠質瘤細胞株U87及LN229由西南大學實驗室提供；DMEM培養基和胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自美國Gibco公司；CCK8試劑盒購自日本Dojindo公司；Seahorse XF Glycolysis Stress Test Kit試劑盒購自美國Agilent公司，反轉錄試劑盒購自日本Toyobo公司；Power SYBR?Green PCR Master MIX 試劑盒購自美國Life公司；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠試劑盒購自北京索萊寶公司；兔抗人c-myc多克隆抗體購自美國CST公司。

1.2 細胞培養

U87及LN229細胞均用含10%(體積分數)FBS的DMEM高糖培養基培養，隔天換培養液，達到指數生長期胰蛋白酶消化傳代，置于5%(體積分數)CO2，37 ℃培養箱中。

1.3 細胞活力檢測

采用CCK8試劑檢測細胞增生。取對數生長期細胞，消化離心后，以5 000個/孔的細胞密度接種于96孔板中，細胞貼壁24 h后，替換含不同濃度β-HB的細胞培養基(0、40、60、80、100、120 mmol/L)，每組設置5個復孔，處理48 h后，每孔加入含10%(體積分數)的CCK8試劑的完全培養基，放入培養箱孵育2 h，酶標儀檢測450 nm處的吸光度。

1.4 細胞糖酵解實驗

糖酵解壓力試劑盒檢測細胞糖代謝水平。取對數生長期細胞，以5 000個/孔的細胞密度接種于Seahorse XFe24專用24孔板中，貼壁后替換含不同濃度的β-HB培養基(0、60、80 mmol/L)，每組設置5個復孔。實驗前配制不含葡萄糖的基礎培養基，調節pH值為7.4。水化Seahorse XFe24專用探針板12～72 h。處理細胞48 h后，將24孔板中DMEM培養基更換為基礎培養基，放入培養箱中孵育1 h。根據試劑盒說明書，配制并稀釋葡萄糖、寡霉素及2-脫氧葡萄糖至所需濃度，加入到測試板中，按說明書上機檢測。Seahorse XF糖酵解壓力試劑盒檢測不同濃度β-HB(0、60、80 mmol/L)作用于腦膠質瘤細胞48 h后的細胞外酸化速率(extracellular acidification rate，ECAR)，并對細胞的糖酵解能力進行統計。

1.5 實時定量聚合酶鏈式反應 (real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)法檢測

取經過β-HB處理的細胞，用Trizol法提取細胞內總RNA。反轉錄試劑盒反轉合成cDNA。以β-Actin 為內參，Power SYBR?Green PCR Master MIX進行RT-qPCR檢測，引物序列：c-myc 正向序：5′-CCTGGTGCTCCATGAGGAGA-3′；反向序列:5′-CTCCAGCAGAAGGTGATCCAGA-3′；β-actin正向序列：5′-GGGAAATCGTGCGTGACATTAAG-3′；反向序列5′-TGTGTTGGCGTACAGGTCTTTG-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。擴增條件為：50 ℃ 2 min 升溫，95 ℃ 10 min初始變性，95 ℃ 15 s 變性，60 ℃ 1 min退火延伸，其中初始變性、變性、退火延伸3步驟重復40個循環。并用2-ΔΔCT法比較表達量的差異。

1.6 Western blotting法檢測

取經過β-HB處理的細胞，PBS洗3次，以PMSF：RIPA=1∶100的比例配置蛋白裂解液，裂解細胞提取蛋白。并用BCA蛋白定量法測定蛋白含量，100 ℃煮沸10 min。變性蛋白等質量、等體積上樣于10%(質量分數)分離膠的聚丙烯酰凝膠中，經電泳、電轉、洗膜后，PVDF膜用含5%(質量分數)脫脂奶粉的1×TBST室溫封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜。第2天回收一抗，用1×TBST洗膜3次后，加入熒光二抗，室溫下避光孵育1 h，1×TBST洗膜后，用Odyssey CLx儀檢測蛋白條帶。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 β-HB在體外對腦膠質瘤細胞生長的影響

用不同濃度β-HB(0、40、60、80、100、120 mmol/L)處理腦膠質瘤細胞48 h后，CCK8 檢測細胞的增生情況，β-HB對 LN229及U87細胞的生長抑制隨著藥物濃度增加而升高，呈現出濃度依賴性，詳見圖1。

圖1 β-HB對腦膠質瘤細胞U87及LN229的生長抑制作用Fig.1 Effect of β-HB on proliferation ability in glioma cell lines U87 and LN229

2.2 β-HB對腦膠質瘤細胞糖酵解水平的影響

與對照組相比，β-HB處理后細胞糖酵解水平下降。在U87細胞中，3組間細胞糖酵解水平差異有統計學意義(F=39.511，P=0.000)，其中兩兩比較60 mmol/L組最大糖酵解能力為(25.53±3.07)mpH/min，與對照組相比(28.49±2.52)mpH/min差異無統計學意義，80 mmol/L組最大糖酵解能力為(11.83±1.49)mpH/min，與對照組相比明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。在LN229細胞中，60 mmol/L組和80 mmol/L組最大糖酵解能力分別為(7.37±2.50)mpH/min、(6.11±2.03)mpH/min，與對照組相比(11.50±1.38)mpH/min明顯降低，差異有統計學意義(F=5.828，P<0.05)，詳見圖2。

2.3 β-HB對腦膠質瘤細胞c-myc基因水平的影響

不同濃度β-HB(0、60、80 mmol/L)分別處理細胞24 h及48 h，檢測c-myc的基因及c-myc蛋白表達量。與對照組相比，在U87細胞中，實驗組c-myc基因表達量均下降且差異有統計學意義(F=1654.61，P=0.000)，LN229細胞中c-myc基因表達量均下降且差異有統計學意義(F=161.94，P<0.05)，詳見圖3。

3 討論

葡萄糖代謝異常是腫瘤細胞的顯著特征大多數腫瘤細胞表現為葡萄糖攝取增加、糖酵解速率加快以及乳酸生成增多。雖然糖酵解是一種低效的產能方式(一分子葡萄糖僅能產生2分子ATP，而有氧氧化可生成38或36分子ATP)，但其產生ATP的速率是有氧氧化的10～100倍[13]，所以通過糖酵解就能更快且更多的生成ATP，滿足腫瘤細胞快速增生的需要。另外，磷酸戊糖途徑產生的NADPH及5-磷酸核苷，可以被腫瘤細胞利用，合成核酸和脂質等生物大分子，這些都是腫瘤細胞生長和增生必不可少的。因此，干預這一過程為腫瘤治療提供了新思路。

KD模擬了人體的饑餓狀態，迫使機體以脂肪作為能量代謝的主要物質。脂肪則在肝內通過β氧化生成酮體。β-HB不僅是脂肪的代謝產物，其本身就具有抗腫瘤作用。在KD的基礎上使用酮類補充劑，可以增強KD的效果，甚至在單獨用于某些疾病時也是有效的。此外，β-HB具有多種信號功能，包括與細胞表面受體結合調節細胞過程，并間接的改變其他代謝產物的水平[14]。Shukla等[15]的研究顯示，β-HB可以下調胰腺癌細胞葡萄糖轉運體-1(glucose transporter 1，GLUT1)及乳酸脫氫酶A(lactate dehydrogenase-A，LDHA)的表達，使細胞葡萄糖攝取、糖酵解通量及谷氨酰胺攝取量降低。

圖2 β-HB處理腦膠質瘤細胞U87及LN229后糖酵解水平Fig.2 Glycolytic capacity in glioma cell lines U87 and LN229 after treated with β-HB

A：U87 treated with different concentrations of β-HB；B：LN229 treated with different concentrations of β-HB；C：glycolytic capacity in U87；D：glycolytic capacity in LN229.*P<0.05，**P<0.01;β-HB:β-hydroxybutyrate;ECAR：extracellular acidification rate；2-DG：2-deoxyglucose.

圖3 β-HB處理腦膠質瘤細胞U87及LN229后c-myc表達水平Fig. 3 Protein and mRNA expression of c-myc after treated with β-HB in U87 and LN229

A： Expression of c-myc protein in U87 was assayed by Western blotting;B： Expression of c-myc protein in LN229 was assayed by Western blotting;C： Relative mRNA expression of U87 c-myc was determined by RT-qPCR；D： Relative mRNA expression of LN229 c-myc was determined by RT-qPCR;***P<0.001;β-HB:β-hydroxybutyrate;RT-qPCR:real-time quantitative polymerase chain reaction.

本研究中，首先探討了β-HB對腦膠質瘤細胞系U87及LN229的作用，發現β-HB可以抑制細胞的生長，且呈劑量依賴性。同時，對ECAR進行測定，筆者發現經過β-HB處理后的細胞糖酵解水平及最大糖酵解能力明顯下降，提示β-HB可能通過抑制細胞糖酵解，從而抑制細胞生長。雖然本研究已經驗證了KD對體外膠質瘤細胞的抑制作用，但是由于體內與體外腫瘤生長環境的差異性，還需進一步研究β-HB對原位腦腫瘤動物模型的效應。

C-myc是由myc原癌基因編碼的一種轉錄因子，參與細胞的增生、轉化及凋亡等生理過程。在結腸癌、乳腺癌、前列腺癌和腦膠質瘤等許多腫瘤中都存在myc基因表達失調。早期研究[16]顯示，c-myc可以與LDHA的啟動子結合并誘導LDHA表達增加，這將c-myc與葡萄糖代謝調節聯系起來。隨后的研究[17-18]表明，c-myc還可以調節GLUT1、己糖激酶-2(hexokinase 2，HK2)、磷酸果糖激酶-M 1(phosphofructokinase M1，PFKM1)和烯醇化酶-1(enolase 1，ENO1)的表達，增加葡萄糖轉運及分解代謝。

因此，腫瘤中過表達c-myc可以增強細胞的“沃伯格”效應。本研究中檢測了經過β-HB處理后細胞c-myc的表達情況，發現c-myc基因及c-myc蛋白都有不同程度的降低，說明β-HB可能通過降低c-myc基因的表達從而抑制細胞的糖酵解水平，進而使細胞的生長停滯。但β-HB是否是通過c-myc調控糖酵解過程中的關鍵酶表達，亦或是其他信號通路影響膠質瘤細胞的代謝還需進一步探究。

綜上所述，本研究探討了β-HB在腦膠質瘤細胞增生及糖酵解方面的影響，證明β-HB能夠抑制腦膠質瘤細胞的增生，且對其糖酵解水平的抑制也隨濃度升高而增強，而β-HB對腦膠質瘤細胞增生及糖酵解的抑制作用可能是由于下調c-myc基因導致的。根據“沃伯格”效應的原理，本研究提示KD治療腦膠質瘤是可行的。通過高脂肪低碳水化合物的飲食方式，提高體內β-HB濃度，或使用酮類補充劑以及抑制酮體代謝過程中的關鍵酶使體內β-HB維持在一個適當的濃度，從而達到控制腫瘤的目的，這為膠質瘤地治療提供了新思路。