3T3-L1前體脂肪細胞誘導分化方法優化的初步探討

趙 蕾 鄭美麗 楊 梅 鐘久昌 楊新春

(首都醫科大學附屬北京朝陽醫院心臟中心 北京市高血壓重點實驗室, 北京 100020)

肥胖是一項世界性健康難題，往往導致內分泌系統和心血管系統疾病的發生。闡明肥胖發生的分子機制并以此為基礎治療肥胖是目前醫學研究的熱點[1]。小鼠3T3-L1前體脂肪細胞是最常用來研究脂肪細胞的細胞系之一，通過序貫加入一定劑量的誘導劑，即經典雞尾酒法，可得到分化成熟的脂肪細胞[2]。然而，傳統雞尾酒法包括的誘導劑，即3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine, IBMX)、地塞米松、胰島素，使用后存在誘導效率低、分化效果不理想的問題[3]。因此，本研究旨在優化誘導3T3-L1前體脂肪細胞分化過程，通過比較不同成分誘導劑誘導分化成熟脂肪細胞的效率，以期獲得一種高效的前體脂肪細胞誘導方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小鼠前體脂肪細胞3T3-L1購自國家實驗細胞資源共享平臺、中國醫學科學院基礎研究所細胞中心。高糖DMEM、新生小牛血清(new calf serum, NCS)、0.25%(質量分數)胰酶、Penicillin-Streptomycin (雙抗)(10 000 U/mL)購自美國Gibco公司，胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購自美國Hyclone公司，IBMX、胰島素、地塞米松、吲哚美辛、羅格列酮購自德國Sigma公司，油紅O染色液試劑盒購自北京索萊寶公司，三酰甘油測試盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 誘導分組

細胞按照不同誘導劑A組成成分，分為4組：(1)對照組(經典雞尾酒法)：IBMX(0.5 mmol/L)、胰島素(10 mg/L)、地塞米松(1.0 μmol/L)；(2)羅格列酮干預組：在經典雞尾酒成分基礎上，加用羅格列酮(2.5 μmol/L)；(3)吲哚美辛干預組：在經典雞尾酒成分基礎上，加用吲哚美辛(0.2 mmol/L)；(4)羅格列酮和吲哚美辛聯合干預組：在經典雞尾酒成分基礎上，加用羅格列酮(2.5 μmol/L)和吲哚美辛(0.2 mmol/L)。

1.3 3T3-L1前體脂肪細胞誘導分化

小鼠3T3-L1前體脂肪細胞在含有10%(體積分數)NCS、100 U/mL Penicillin-Streptomycin的DEME培養基中培養，當細胞匯合度達到90%左右，傳代并以5×105密度接種于6孔板中，待細胞生長至完全匯合后，接觸抑制2 d，計為誘導分化0 d，更換新鮮培養基DMEM+10%(體積分數)FBS(2.5 mL/孔)，分組加入誘導劑A，混勻，3 d更換誘導劑B(胰島素10 mg/L)，繼續培養2 d后更換基礎培養基DMEM+10%(體積分數)FBS，培養至11 d，得到誘導分化成熟的脂肪細胞。

1.4 油紅O染色

分別于5、7、9、11 d顯微鏡下觀察各組細胞形態變化，于11 d收集細胞并行油紅O染色。采用索萊寶公司油紅O染色液試劑盒，具體操作步驟如下：(1)移除培養基，PBS洗3次，加入ORO Fixtative固定液固定30 min；(2)棄去固定液，用去離子水洗2次；(3)加入60%(體積分數)異丙醇浸洗5 min；(4)棄去60%(體積分數)異丙醇(1 ml/孔)，加入ORO Stain染液，浸染20 min；(5)棄去染色液，去離子水洗5遍，直到無多余染液，置于顯微鏡下觀察、拍照，并運用Image Pro Plus 6.0圖像處理軟件統計經油紅O染色后脂滴直徑、數量以及脂滴面積。去除油紅O染液，PBS洗3遍，每孔加入600 μL 60%(體積分數)異丙醇，室溫靜置30 min后，將溶液轉移至96孔板中，酶標儀讀取510 nmA值。

1.5 三酰甘油含量測定

于11 d收集各組細胞培養液，1 000 r/min，離心10 min，取上清后，參照三酰甘油測定試劑盒說明書，分別在96孔板中加入蒸餾水、校準品、待測樣品以及工作液后，37 ℃孵育10 min，酶標儀讀取510 nmA值，測得細胞分泌的三酰甘油濃度。收集各組細胞，PBS洗2遍，1 000 r/min，離心10 min，留取細胞沉淀，加入細胞裂解液100 μL，冰上裂解細胞30 min，裂解好的液體不離心，直接參照三酰甘油測定試劑盒說明書步驟，酶標儀讀取510 nmA值。采用BCA法進行細胞內蛋白濃度定量后，根據公式計算得到細胞內三酰甘油濃度。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 3T3-L1前體脂肪細胞誘導分化后細胞形態學變化

3T3-L1前體脂肪細胞誘導分化前呈梭形，胞質均一無脂滴，誘導5 d后，各組細胞從梭形逐漸變成橢圓形，胞質飽滿，體積較誘導前增大。誘導7 d，細胞體積繼續增大，其中羅格列酮干預組、吲哚美辛干預組以及聯合干預組的細胞胞質中開始出現零散的較明顯的小脂滴，而對照組細胞不僅體積較小，同時未見明顯脂滴形成。誘導9 d，各組細胞胞質中脂滴進一步增加，主要分布于細胞核周圍，形成“戒環”，此時羅格列酮干預組、吲哚美辛干預組以及聯合干預組細胞形成的脂滴分布較均勻，且形成的脂滴數量也明顯較對照組多，與羅格列酮干預組、吲哚美辛干預組以及聯合干預組相比，對照組不僅形成脂滴少，而且脂滴也偏小。11 d，各組細胞脂滴進一步增大，多個脂滴融合，形成大脂滴，相比羅格列酮干預組、吲哚美辛干預組以及聯合干預組，對照組脂滴少且小(圖1)。

2.2 油紅O染色

油紅O染色鑒定成熟脂肪細胞形成。如圖2所示，羅格列酮干預組和聯合干預組細胞形成的脂肪脂滴較對照組和吲哚美辛干預組多。定量檢測結果顯示，羅格列酮干預組酶標儀510 nm測得的A值為2.22±0.17，聯合干預組1.67±0.04，兩組A值均明顯高于對照組0.75±0.03(P<0.001)。吲哚美辛組測得的A值為0.89±0.02，與對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

圖1 3T3-L1前體脂肪細胞誘導分化過程中形態學變化Fig.1 Morphological changes during 3T3-L1 preadipocytes differentiation (100×)Control: normal control; Ros: rosiglitazone; Indo: indometacin; Ros+Indo: rosiglitazone+ indometacin.

圖2 3T3-L1前體脂肪細胞誘導分化為成熟脂肪細胞后油紅O鑒定Fig.2 Adipocyte formation determined by oil red stainingControl: normal control; Ros: rosiglitazone; Indo: indometacin; Ros+Indo: rosiglitazone+ indometacin.

采用Image Pro Plus 6.0軟件統計經油紅O染色后的脂滴，如表1所示，一個視野下脂滴數量和脂滴總面積對照組均明顯小于其余3組。單個脂滴具體參數中，羅格列酮組的平均直徑大于對照組[(7.36±0.21)μmvs(5.60±0.26)μm,P<0.05]，平均面積大于對照組[(54.92±4.49)μmvs(21.97±2.26)μm2,P<0.05]，最大直徑大于對照組[(10.49±0.39)μmvs(7.45±0.43)μm,P<0.01]。聯合干預組的脂滴平均直徑大于對照組[(7.86±0.23)μmvs(5.60±0.26)μm,P<0.001]，平均面積大于對照組[(65.31±5.37)μmvs(21.97±2.26)μm2,P<0.01]，最大直徑大于對照組[(10.40±0.34)μmvs(7.45±0.43)μm,P<0.05]。而吲哚美辛組與對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。羅格列酮組和吲哚美辛組相比，羅格列酮組形成脂滴的最大直徑大于吲哚美辛組，聯合干預組形成脂滴的平均直徑和平均面積，均大于吲哚美辛單獨干預組，而與羅格列酮單獨干預組,差異無統計學意義(P>0.05, 圖3)。

表1 3T3-L1成熟脂肪細胞脂滴參數Tab.1 Parameters of mature 3T3-L1 adipocyte

圖3 3T3-L1成熟脂肪細胞各組脂滴參數Fig.3 Parameters of mature 3T3-L1 adipocyte in each group

A: mean diameter of adipocyte;B: mean area of adipocyte;C: maximum diameter of adipocyte;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;Control: normal control;Ros: rosiglitazone;Indo: indometacin;Ros+Indo: rosiglitazone+ indometacin.

2.3 3T3-L1細胞中三酰甘油含量測定

油紅O染色后定量檢測間接反映胞內三酰甘油含量，羅格列酮干預組和聯合干預組明顯高于其他組(圖4A)。通過試劑盒直接檢測細胞內形成的三酰甘油含量，對照組(0.19±0.02)mmol/g，羅格列酮組(0.51±0.11)mmol/g，吲哚美辛組(0.50±0.18)mmol/g，聯合干預組(0.77±0.07)mmol/g，其中聯合干預組明顯高于對照組(P<0.05)(圖4B)。最后檢測培養基中三酰甘油含量，對照組的三酰甘油含量為(0.08±0.04)mmol/g，羅格列酮組(0.28±0.06)mmol/g，吲哚美辛組(0.30±0.07)mmol/g，聯合干預組(1.17±0.65)mmol/g，各組間差異無統計學意義(F=0.92，P=0.47)。

3 討論

3T3-L1前體脂肪細胞作為一種小鼠胚胎成纖維細胞，具有一定的定向分化潛能。當給予一定劑量的誘導劑，激活脂肪細胞分化信號通路，可以在誘導劑作用下促使3T3-L1前體脂肪細胞分化成為成熟脂肪細胞[4-5]，而如何得到數量較多且分化程度較高的成熟脂肪細胞對于后續實驗的進行也是至關重要。本研究在經典雞尾酒誘導劑的基礎上，分別加用羅格列酮和/或吲哚美辛，觀察對于3T3-L1前體脂肪細胞誘導分化的影響，并通過油紅O染色鑒定、三酰甘油含量測定評價各組誘導分化效率。研究[5]顯示，羅格列酮加用后前體脂肪細胞誘導分化效率明顯提高，而加用吲哚美辛的效果不及羅格列酮。

圖4 誘導分化成熟的3T3-L1脂肪細胞中三酰甘油含量Fig.4 Triglyceride (TG) contents in mature 3T3-L1 adipocyte

A: absorbance at 510 nm of quantified oil red staining;B: intracellular TG contents determined by enzymatic assay;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;Control: normal control;Ros: rosiglitazone;Indo: indometacin;Ros+Indo: rosiglitazone+ indometacin；TG：triglyceride.

3T3-L1前體脂肪細胞在誘導分化過程中，主要通過調控一系列誘導分化的轉錄因子表達實現成脂過程[6]，其中過氧化物酶體增生因子活化γ型受體(peroxisome proliferator-activated receptor, PPAR-γ)是關鍵因子之一[7]。PPAR是調控目標基因表達的核內受體轉錄因子超家族，根據結構不同，分為α、β、γ 3種類型，其中PPAR-γ主要調控脂肪細胞分化和胰島素抵抗[8]。羅格列酮，屬于噻唑烷二酮類胰島素增敏劑，也是特異性PPAR-γ高效激動劑[9]。

本研究中，在經典雞尾酒誘導劑基礎上加用羅格列酮后，3T3-L1前體脂肪細胞更早出現脂滴，形成的脂滴也較對照組多，同時三酰甘油含量也較多，提示羅格列酮通過進一步激活PPAR-γ促進成脂過程。吲哚美辛，屬于非甾體類抗炎藥，已有研究[10]顯示，非甾體類抗炎藥也可以與PPAR-γ結合并使其活化。本研究中加用吲哚美辛后，前體脂肪細胞也較早形成脂滴，但是脂滴直徑與面積以及三酰甘油濃度與對照組差異無統計學意義(P>0.05)，因此，相比羅格列酮，吲哚美辛激動PPAR-γ能力較弱。在三酰甘油生成含量的測定中，雖然油紅O染色間接定量中，加用PPAR-γ激動劑后生成含量增加，但是直接法測定的胞外三酰甘油濃度經過蛋白含量校正后，4組間差異無統計學意義。而在同時加用吲哚美辛和羅格列酮的誘導劑誘導過程中，細胞內形成的三酰甘油濃度高于對照組，單用以上兩種藥物生成的三酰甘油濃度并沒有任何優勢，因此提示可以適量加用兩種及以上藥物共同激動PPAR-γ表達，促進成脂過程，增加胞內三酰甘油濃度。如何進一步提高胞外三酰甘油濃度以及藥物濃度是否影響誘導分化過程亟須進一步明確。

本研究初步提示在經典雞尾酒誘導劑基礎上適量加用PPAR-γ受體激動劑，可有效提高3T3-L1前體脂肪細胞分化效率，增加三酰甘油濃度，為后續以脂肪細胞為基礎的實驗提供一個較理想的細胞模型。有關PPAR-γ受體激動劑的選用，目前推薦噻唑烷二酮類羅格列酮，較非甾體類抗炎藥誘導分化效果更好。