27-羥基膽固醇對神經(jīng)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞溶酶體膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)因子表達(dá)的影響

陳 思 周 催 余輝艷 陶領(lǐng)偉 王玉珊 肖 榮

(首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系 環(huán)境毒理學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069)

由于外周循環(huán)中的膽固醇無法直接通過血-腦脊液屏障(blood brain barrier，BBB)進(jìn)入腦內(nèi)，腦內(nèi)的膽固醇主要由星形膠質(zhì)細(xì)胞合成并與膽固醇載脂蛋白E(apolipoprotein E, ApoE)結(jié)合形成膽固醇-ApoE復(fù)合物[1]。膽固醇-ApoE復(fù)合物被運(yùn)送到神經(jīng)細(xì)胞溶酶體中，由尼曼匹克蛋白質(zhì)(Niemann-Pick C protein，NPC)實(shí)現(xiàn)膽固醇在溶酶體中的轉(zhuǎn)運(yùn)。NPC2蛋白質(zhì)首先與膽固醇的烷基側(cè)鏈部分進(jìn)行結(jié)合, 之后NPC1蛋白質(zhì)與膽固醇繼續(xù)結(jié)合，把膽固醇運(yùn)送到溶酶體膜上[2]，并與突觸結(jié)合蛋白VII(Syt7)合作將膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)到下游細(xì)胞器進(jìn)行利用，這一系列過程對維持神經(jīng)細(xì)胞的功能具有重要作用。研究[3-6]顯示，NPC基因缺陷可導(dǎo)致膽固醇堆積在細(xì)胞溶酶體內(nèi)不能正常轉(zhuǎn)運(yùn)，并且神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生、發(fā)展與神經(jīng)細(xì)胞溶酶體內(nèi)NPC蛋白質(zhì)的基因下調(diào)有關(guān)。

27-羥基膽固醇(27-hydroxycholesterol，27-OHC)是外周膽固醇的氧化產(chǎn)物之一，可以自由通過血-腦脊液屏障，也是腦中最豐富的氧化固醇[7]。許多研究[8-9]顯示，阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease, AD)患者血清及腦脊液(cerebrospinal fluid, CSF)中的27-OHC濃度升高與AD患者腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞的萎縮程度以及活性的喪失有關(guān)[10-11]，這些研究表明27-OHC在神經(jīng)細(xì)胞變性中起著關(guān)鍵作用。本課題組前期動(dòng)物及細(xì)胞研究[12-13]顯示，27-OHC可引起SD大鼠神經(jīng)細(xì)胞溶酶體功能異常，且27-OHC對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，并對腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育及星形膠質(zhì)細(xì)胞膽固醇合成與轉(zhuǎn)運(yùn)產(chǎn)生影響；提示27-OHC可能通過干擾溶酶體結(jié)構(gòu)和功能引起腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育及星形膠質(zhì)細(xì)胞膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的異常，但是27-OHC在神經(jīng)細(xì)胞溶酶體中的作用及具體機(jī)制尚不明確。

本研究通過神經(jīng)細(xì)胞-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體系模擬神經(jīng)系統(tǒng)自然狀態(tài)，研究27-OHC對神經(jīng)細(xì)胞以及星形膠質(zhì)細(xì)胞膽固醇濃度及溶酶體NPC基因表達(dá)的影響，為深入研究氧化固醇對退行性神經(jīng)疾病中的細(xì)胞機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞

選用SH-SY5Y細(xì)胞系(人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞)和C6細(xì)胞系(大鼠星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞)作為研究對象，分別購自北京協(xié)和細(xì)胞資源中心(CRC/PUMC)和中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。將細(xì)胞生長于含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清和10 U/L 青鏈霉素的DMEM中，于37 ℃、5.0%(體積分?jǐn)?shù))CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.2 主要儀器與試劑

主要儀器：恒溫培養(yǎng)箱(Sanyo公司，日本)、酶標(biāo)儀(Tecan公司，瑞士)、反轉(zhuǎn)錄儀(Bio-Rad公司，美國)、Real-Time PCR分析儀(Bio-Rad公司，美國)、分子成像系統(tǒng)(Vilber公司，法國)。

試劑：27-羥基膽固醇購于美國Santa Cruz公司；二甲基亞砜(DMSO)購于美國Sigma公司;細(xì)胞總膽固醇測試盒購于南京建成生物工程研究所；BCA蛋白定量試劑盒購于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；Real-time PCR引物購于生工生物工程(上海)股份有限公司；Anti-Niemann Pick C1和Anti-Niemann Pick C2抗體購于美國Abcam公司；Anti-Niemann Pick C1和Anti-Niemann Pick C2 引物購于生工生物工程(上海)股份有限公司。

主要試劑配制：27-羥基膽固醇10 mg完全溶于適量乙醇，配置成1 000 μmol/L儲備液分裝在1.5 mL離心管中，每管1 mL儲備液用氮吹儀吹干，于-80 ℃保存。臨用時(shí)，每離心管中加入200 μL DMSO用于溶解27-OHC，并加入800 μL DMEM配制成1 000 μmol/L的儲備液，之后配成工作液(5、10、20 μmol/L)。

1.2 方法

1.2.1 建立細(xì)胞共培養(yǎng)體系

模擬神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境，SH-SY5Y細(xì)胞和C6細(xì)胞在Trans-well系統(tǒng)中共培養(yǎng)。SH-SY5Y細(xì)胞(1.0×106/mL)接種于6孔板上，C6細(xì)胞(1.0×106/mL)接種于上室的聚碳酸酯膜上(孔徑0.4 μm，直徑30 mm)。上下兩室分別加入DMEM完全培養(yǎng)基進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)，4 h后將插入式培養(yǎng)皿接種于6孔板中，對照組加無血清DMEM，處理組進(jìn)行27-OHC+無血清DMEM干預(yù)。

1.2.2 細(xì)胞分組與處理

接種細(xì)胞濃度為1.0×106/mL，當(dāng)細(xì)胞生長密度達(dá)到80%～90%時(shí)，對細(xì)胞進(jìn)行分組處理：對照組、27-OHC(低、中、高劑量)處理組(分別采用5、10和20 μmol/L 27-OHC處理)，繼續(xù)培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞，待測。

1.2.3 細(xì)胞內(nèi)總膽固醇濃度檢測

細(xì)胞接種密度1.0×106/mL，按照試劑盒說明書收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)漂洗細(xì)胞1次，1 000 r/min離心10 min，棄上清，留細(xì)胞沉淀，細(xì)胞沉淀內(nèi)加入100 μL裂解液裂解40 min。之后按照總膽固醇定量試劑盒說明書提供的操作流程檢測細(xì)胞內(nèi)的總膽固醇濃度，進(jìn)行3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 Real-time PCR檢測

收集細(xì)胞進(jìn)行RNA提取以及反轉(zhuǎn)錄之后，使用Real-time PCR儀檢測NPC1和NPC2的mRNA表達(dá)水平。Real-time PCR系統(tǒng)包含8.2 μL 無核水，10 μL MasterMix(SYBR)，1 μL cDNA和0.8 μL 引物，達(dá)到每個(gè)反應(yīng)體系的總量為20 μL。進(jìn)行3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。PCR引物，詳見表1。

表1 PCR引物序列Tab. 1 Primers used for Real-time PCR

1.2.5 Western blotting檢測

細(xì)胞經(jīng)過24h不同劑量27-OHC處理后，使用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞，并將0.1 mL細(xì)胞裂解緩沖液加入Trans-well小室以及六孔板中對細(xì)胞進(jìn)行裂解。在4 ℃ 13 000g離心15 min收集細(xì)胞提取物。BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒用于測量蛋白質(zhì)濃度。將等量的蛋白質(zhì)(20 μg)加入到8%或10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))SDS-丙烯酰胺凝膠上以通過電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂牛奶封閉1 h后，加入β-Actin(1∶1 000)、NPC1(1∶10 000)、NPC2(1∶2 000) 一抗，孵育過夜。TBST洗滌3次后，加入山羊抗兔的二抗(1∶2 000)，室溫孵育1h后，TBST洗滌3次，發(fā)光劑顯色發(fā)光，Vilber Lourmat Fusion SL6成像分析儀檢測分析，最后通過Image J軟件分析灰度值，進(jìn)行3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 SH-SY5Y和C6細(xì)胞內(nèi)膽固醇濃度

圖1結(jié)果顯示，在中劑量和高劑量27-OHC處理組中，SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)總膽固醇濃度均高于對照組(P=0.000)，且呈現(xiàn)升高趨勢。而C6細(xì)胞內(nèi)總膽固醇濃度呈降低趨勢，27-OHC 10 μmol/L處理組和20 μmol/L組總膽固醇濃度均低于對照組(P<0.05)。

圖1 在5、10和20 μmol/L 27-OHC處理下，SH-SY5Y細(xì)胞和C6細(xì)胞內(nèi)總膽固醇濃度的變化Fig.1 Total cholesterol of cellular protein in SH-SY5Y cells and C6 cells treated with 5, 10 and 20 μmol/L 27-OHC

All data were presented as the means±SD.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group；27-OHC：27-hydroxycholesterol.

2.2 27-OHC對神經(jīng)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞溶酶體膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)因子mRNA水平的影響

與對照組相比，SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)溶酶體NPC1基因表達(dá)下調(diào)，其中27-OHC 5 μmol/L處理組、10 μmol/L處理組及20 μmol/L處理組與對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對照組相比，C6細(xì)胞溶酶體NPC1基因表達(dá)上調(diào)，其中27-OHC 20 μmol/L處理組與對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2A，3A)。

與對照組相比，SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)溶酶體NPC2基因表達(dá)下調(diào)，其中27-OHC 10 μmol/L處理組及20 μmol/L處理組與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對照組相比，C6細(xì)胞溶酶體NPC2基因表達(dá)上調(diào)，其中27-OHC 10 μmol/L處理組及20 μmol/L處理組與對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2B、3B)。

圖2 在5、10和20 μmol/L 27-OHC處理下，SH-SY5Y細(xì)胞和C6細(xì)胞溶酶體NPC基因Real-time PCR溶解曲線Fig.2 Real-time PCR solubility curve of NPC1(A)and NPC2 (B) in SH-SY5Y cells and C6 cells treated with 5, 10 and 20 μmol/L 27-OHCNPC:Niemann-Pick C protein;27-OHC:27-hydroxycholesterol.

圖3 在5、10和20 μmol/L 27-OHC處理下，SH-SY5Y細(xì)胞和C6細(xì)胞溶酶體NPC1和NPC2基因表達(dá)變化Fig.3 mRNA expression of NPC1(A) and NPC2(B) in SH-SY5Y cells and C6 cells treated with 5, 10 and 20 μmol/L 27-OHC*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 vs control group; NPC:Niemann-Pick C protein;27-OHC:27-hydroxycholesterol.

2.3 27-OHC對神經(jīng)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞溶酶體膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)的影響

27-OHC對SH-SY5Y和C6細(xì)胞NPC1和NPC2蛋白質(zhì)表達(dá)的影響如圖4A所示，27-OHC下調(diào)了SH-SY5Y細(xì)胞NPC蛋白質(zhì)表達(dá)，上調(diào)了C6細(xì)胞NPC蛋白質(zhì)表達(dá)。

圖4B顯示，與對照組相比，SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)溶酶體NPC1蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)，其中27-OHC 10 μmol/L處理組及20 μmol/L處理組與對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；C6細(xì)胞與對照組相比，溶酶體NPC1蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)，其中27-OHC 10 μmol/L處理組及20 μmol/L處理組與對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖4C結(jié)果顯示，與對照組比較，SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)溶酶體NPC2蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)，其中27-OHC 10 μmol/L處理組及20 μmol/L處理組與對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；C6細(xì)胞溶酶體NPC2蛋白質(zhì)與對照組相比，蛋白質(zhì)表達(dá)呈上調(diào)趨勢，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖4 在5、10和20 μmol/L 27-OHC處理下，SH-SY5Y細(xì)胞和C6細(xì)胞溶酶體NPC1和NPC2 蛋白質(zhì)表達(dá)變化Fig.4 Protein levels of NPC1 (B) and NPC2 (C) in SH-SY5Y cells and C6 cells treated with 5, 10 and 20 μmol/L 27-OHC

The results of Western blotting (A). All data were presented as the means±SD.*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vscontrol group;NPC:Niemann-Pick C protein;27-OHC:27-hydroxycholesterol.

3 討論

越來越多的研究[14-15]顯示，27-OHC對腦內(nèi)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)具有調(diào)節(jié)作用，腦內(nèi)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)障礙可能與27-OHC濃度的異常升高有關(guān)。本研究為更好的模擬神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境，選取神經(jīng)細(xì)胞(SH-SY5Y)[16]、星形膠質(zhì)細(xì)胞(C6細(xì)胞)采用Trans-well小室共培養(yǎng)[17]，通過檢測神經(jīng)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的膽固醇濃度以及溶酶體轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇的特異性蛋白質(zhì)NPC1和NPC2的基因蛋白質(zhì)表達(dá)情況，探討27-OHC對腦細(xì)胞溶酶體內(nèi)膽固醇穩(wěn)態(tài)的影響。本研究對共培養(yǎng)狀態(tài)下的SH-SY5Y和C6細(xì)胞進(jìn)行5、10、20 μmol/L 27-OHC(高于典型生理濃度[13]處理，以模擬腦中膽固醇由星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)到神經(jīng)細(xì)胞的過程以及27-OHC向腦內(nèi)流入的機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，27-OHC處理導(dǎo)致SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)總膽固醇濃度特異性升高，C6細(xì)胞內(nèi)總膽固醇濃度特異性降低，這說明27-OHC處理破壞了SH-SY5Y及C6細(xì)胞內(nèi)的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)平衡。本課題組前期研究[18]顯示，27-OHC處理的SD大鼠腦膽固醇濃度升高；C6細(xì)胞作為膽固醇合成的主要細(xì)胞，27-OHC處理可以影響C6細(xì)胞膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)，并通過增強(qiáng)ABCA1和ApoE的表達(dá)促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞中的膽固醇外流[19]， Ali等[20]研究發(fā)現(xiàn)27-OHC是腦中膽固醇合成的生理抑制劑，這些結(jié)果均與本研究得到的結(jié)果一致，但是膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)障礙是否與細(xì)胞溶酶體內(nèi)膽固醇儲存以及轉(zhuǎn)運(yùn)功能有聯(lián)系尚未進(jìn)行研究。NPC1和NPC2是溶酶體內(nèi)膽固醇儲存和轉(zhuǎn)運(yùn)的特異性蛋白質(zhì)[21]，本研究顯示，通過27-OHC處理可導(dǎo)致SH-SY5Y細(xì)胞溶酶體蛋白質(zhì)NPC1和NPC2基因及蛋白質(zhì)水平下調(diào)；在C6細(xì)胞中，27-OHC處理可導(dǎo)致NPC1基因及蛋白質(zhì)水平上調(diào)。相關(guān)研究[22]顯示，在NPC1基因缺陷小鼠的神經(jīng)細(xì)胞中有膽固醇積累，神經(jīng)軸突發(fā)生異常腫脹，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡；神經(jīng)細(xì)胞溶酶體中NPC1和NPC2基因表達(dá)缺陷會導(dǎo)致膽固醇在溶酶體中蓄集，從而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞膜修復(fù)、神經(jīng)軸突生長和突觸可塑性所需的膽固醇濃度低下[23-24]。以上表明，NPC1和NPC2蛋白質(zhì)異常表達(dá)會影響膽固醇在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而造成神經(jīng)細(xì)胞損傷。本研究通過對SH-SY5Y人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中總膽固醇濃度以及溶酶體NPC蛋白質(zhì)進(jìn)行研究，推測27-OHC處理可引起溶酶體膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)障礙從而導(dǎo)致膽固醇蓄積。本課題組前期研究[19]顯示，27-OHC可促進(jìn)C6細(xì)胞內(nèi)膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)，本研究中C6細(xì)胞內(nèi)溶酶體NPC蛋白質(zhì)的表達(dá)升高會促進(jìn)溶酶體中的膽固醇外流，以上研究結(jié)果有可能為星形膠質(zhì)細(xì)胞中膽固醇濃度的降低提供證據(jù)。

綜上，27-OHC可通過下調(diào)神經(jīng)細(xì)胞中尼曼匹克蛋白質(zhì)(NPC)的表達(dá)水平引起膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)功能異常，使膽固醇在神經(jīng)細(xì)胞溶酶體內(nèi)蓄積，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)障礙。關(guān)于27-OHC對神經(jīng)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體系中細(xì)胞溶酶體功能的影響作用機(jī)制，還有待于進(jìn)一步研究。