N-乙酰半胱氨酸對膜性腎病大鼠腎臟的保護(hù)作用

楊琳琳 王玉潔 劉剛 程閏夏 彭素英 曹靈

1西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腎病內(nèi)科（四川瀘州646000）；2北京大學(xué)第一醫(yī)院腎病內(nèi)科/北京大學(xué)腎臟疾病研究所（北京100034）；3重慶市涪陵中心醫(yī)院（重慶408000）

膜性腎病（membranous nephropathy，MN）是成人腎病綜合征最常見的病理類型，約占33%，在中老年患者中比例更高。全世界范圍內(nèi)，每年約有10萬例新發(fā)病例［1］。近年來，我國MN發(fā)病率呈明顯增加趨勢［2］，其診治正受到廣泛重視。

經(jīng)過半個多世紀(jì)的深入研究，目前已知MN發(fā)病機制的核心環(huán)節(jié)是腎小球足細(xì)胞下免疫復(fù)合物形成、激活補體導(dǎo)致足細(xì)胞損傷和基底膜改變，后期隨著腎小球的嚴(yán)重?fù)p傷，腎小管出現(xiàn)萎縮，腎間質(zhì)淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤、纖維化，最終導(dǎo)致整個腎臟受損。氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可促進(jìn)足細(xì)胞在內(nèi)的多種腎臟固有細(xì)胞的損傷，參與多種腎臟疾病發(fā)病及惡化［3-6］，但它是否參與MN的進(jìn)程以及有效拮抗是否能起到減輕疾病的癥狀目前尚未有報道。MN是一組發(fā)展緩慢、病程遷延的疾病，自然預(yù)后差別大，約30%可自行緩解，約50%的患者可在10～20年內(nèi)進(jìn)展至終末期腎病［7］。最新國際指南的治療建議［8］是：先保守治療6個月，未獲得自發(fā)緩解，再予以糖皮質(zhì)激素聯(lián)合免疫抑制劑治療。而在這一治療過程中，如果能找到方便臨床使用的有效的治療新選擇也是一件非常有意義的工作。

N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）是一種含有巰基的化合物，有黏液溶解作用，作為祛痰藥廣泛應(yīng)用于臨床。它同時具有干擾自由基產(chǎn)生、清除已形成的自由基、抗細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)免疫等作用［9］。已有少量研究顯示NAC可降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平，改善醛固酮誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞的凋亡［10］；NAC也可降低氧化應(yīng)激水平，減少糖尿病大鼠足細(xì)胞凋亡［11］。但在MN動物模型中系統(tǒng)觀測NAC療效及機理尚缺乏專門報道。本研究應(yīng)用陽離子化牛血清白蛋白制備大鼠MN模型，觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化應(yīng)激的參與情況，以及NAC是否通過相應(yīng)的拮抗起到對MN大鼠腎臟的保護(hù)作用，以期為MN的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器與試劑N-乙酰半胱氨酸（海南贊邦制藥有限公司，批號：H20080326，規(guī)格：600 mg/片），兔抗TRAF2多克隆抗體、兔抗Caspase12多克隆抗體（美國Bioworld公司，批號：BS6065、BS3542），兔抗WT-1多克隆抗體（英國Abcam，批號：ab15249），兔抗大鼠IgG抗體、異硫氰酸熒光素標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體、二步法免疫組化試劑盒（中國北京中杉金橋公司，批號：ZB-2040、ZF-0311、SP-9001），MDA（中國武漢純度生物公司，批號：CDY-2566X-SJH），SOD（中國上海晶抗生物工程公司，批號：JKSJ-1821），TUNEL試劑盒（中國江蘇凱基生物公司，批號：KGA-701-TY1163），制備的不完全弗氏佐劑、制備的陽離子化牛血清白蛋白。

1.1.2 實驗動物實驗動物為北京斯貝福生物技術(shù)有限公司提供的體質(zhì)量為（120±20）g的健康，SPF級，雄性SD大鼠 80只。生產(chǎn)許可證：SYK（京）2016-0002，使用許可證：SYK（川）2014-001。動物實驗的開展取得了西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)（動物倫理編號：20170100007）。屏障環(huán)境飼養(yǎng)，自由飲水、進(jìn)食，適宜溫度、濕度。

1.2 研究方法

1.2.1 造模、分組與給藥采用陽離子化牛血清白蛋白制備MN大鼠模型［12］，隨機分為4組：正常組（Control組）、模型組（MN組）、NAC100 mg/kg治療組（NAC1組），NAC 200 mg/kg（NAC2組）。應(yīng)用陽離子化牛血清白蛋白（1 mg/0.5 mL生理鹽水，加等量不完全弗氏佐劑乳化）隔日腹股溝區(qū)、腋下等皮下多部位注射進(jìn)行預(yù)免疫1周，而后采用陽離子化牛血清白蛋白（20 mg/kg）尾靜脈注射進(jìn)行正式免疫，每周注射3次后休息1 d，連續(xù)4周，共注射12次。模型組每次尾靜脈注射陽離子化牛血清白蛋白后給予生理鹽水1mL/d灌胃，NAC1組每次尾靜脈注射陽離子化牛血清白蛋白后給予NAC 100 mg/kg灌胃，NAC2組每次每次尾靜脈注射陽離子化牛血清白蛋白后給予NAC 200 mg/kg灌胃。

1.2.2 尿蛋白及生化指標(biāo)檢測分別于正式免疫后第1、2、3、4周末收集各組大鼠24 h尿液。各組大鼠于正式免疫后第1、2、3、4周末各取5只處死，用1%戊巴比妥（100 mg/kg）0.5 mL腹腔注射麻醉后，心臟取血。血液和尿液行2 500 r/min離心15 min，收集上清液。采用雙縮脲法檢測24 h尿蛋白定量，全自動生化儀檢測血肌酐、血尿素氮、白蛋白。

1.2.3 腎組織病理學(xué)檢查腎組織經(jīng)中性甲醛固定，脫水、透明、浸蠟、包埋、切片后，PASM染色觀察腎組織病理學(xué)變化。間接免疫熒光法觀察腎小球IgG沉積情況，電鏡下觀察上皮下免疫復(fù)合物沉積、足細(xì)胞形態(tài)變化。免疫熒光結(jié)果判定：（-）無熒光；（±）極弱的可疑熒光；（+）清楚可見；（++）熒光明亮；（+++至++++）熒光閃亮。

1.2.4 TUNEL法檢測腎臟固有細(xì)胞凋亡取4 μm石蠟切片脫蠟水化，蛋白酶K修復(fù)，3%H2O2室溫封閉，TdT酶反應(yīng)液，氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素工作液，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。陽性染色半定量分析：每張切片在400倍視野下隨機觀察10個非重復(fù)非硬化的腎小球，腎臟實質(zhì)細(xì)胞胞核棕黃色或棕褐色顆粒為陽性，計算腎組織TUNEL陽性細(xì)胞比例（陽性細(xì)胞個數(shù)/有核細(xì)胞總數(shù)），取其平均值計為腎臟固有細(xì)胞凋亡指數(shù)，以百分?jǐn)?shù)表示［13］。

1.2.5 免疫組化檢測腎組織WT?1、GRP78、TRAF2、Caspase12蛋白表達(dá)采用免疫組化二步法檢測腎組織 WT-1、GRP78、TRAF2、Caspase12蛋白表達(dá)。取4 μm石蠟切片脫蠟水化，EDTA高壓修復(fù)，3%H2O2室溫封閉，分別加入兔抗WT-1抗體（1∶500）、兔抗GRP78抗體（1∶500）、兔抗TRAF2抗體（1∶500）、兔抗Caspase12抗體（1∶500），4 ℃過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，封片，鏡檢。陽性結(jié)果判斷：GRP78、TRAF2、Caspase12以腎實質(zhì)細(xì)胞胞漿內(nèi)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性，WT-1是足細(xì)胞特征性標(biāo)記，以細(xì)胞核棕黃色或棕褐色顆粒為陽性。陽性染色半定量分析：（1）GRP78、TRAF2、Caspase12 每張切片在400倍視野下隨機選取10個視野，采用Image Pro Plus7.0圖像分析處理系統(tǒng)，分別測出各指標(biāo)的陽性區(qū)積分光密度及陽性區(qū)測量面積，兩者相除后即得到平均積分光密度，并用平均積分光密度表示GRP78、TRAF2、Caspase12蛋白相對含量，每張切片的10個視野的平均積分光密度值平均后納入統(tǒng)計分析［14］。（2）WT-1 在400倍顯微鏡下觀察10個非硬化腎小球，陽性細(xì)胞比例（陽性細(xì)胞個數(shù)/有核細(xì)胞總數(shù)），并用陽性細(xì)胞比例表示W(wǎng)T-1蛋白相對含量，每張切片的10個視野的WT-1陽性細(xì)胞比例平均值納入統(tǒng)計分析［13］。

1.2.6 血漿SOD、MDA檢測采用WST法檢測血漿超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD），采用tba法檢測血漿丙二醛（malondialdehyde，MDA）。按照試劑盒說明操作，分別在532 nm和450 nm酶標(biāo)儀處測量測定MDA和SOD吸光光度值，并計算出SOD（U/mL）及MDA（nmol/mL）含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法符合正態(tài)分布計量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，運用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布及方差齊性檢驗時，采用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較；方差不齊時，采用非參數(shù)檢驗的Kruskal-WallisH方法。實驗至少重復(fù)3次，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NAC治療減輕MN大鼠腎病綜合征嚴(yán)重程度與正常組相比，模型組從第2周末開始24 h尿蛋白、血肌酐、血尿素氮升高（P＜0.05），血白蛋白降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組相比，NAC治療組從第3周末開始，24 h尿蛋白、血肌酐、血尿素氮顯著降低（P＜0.05），血白蛋白顯著升高（P＜0.05）。NAC1組和NAC2組比較，各項指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1。

2.2 NAC治療減輕MN大鼠腎臟病理損傷程度正常組病理改變無明顯異常。免疫熒光見模型組IgG呈強陽性（++++），沿腎小球毛細(xì)血管袢和系膜區(qū)顆粒樣沉積；NAC治療組，IgG熒光強度相對較弱（均為++），沉積部位同前者。光鏡見模型組大鼠腎小球基底膜彌漫性增厚，可見少量“釘突”形成（紅色箭頭所示）；NAC治療組除不見“釘突”外，其他與之未見明顯差別。電鏡見模型組腎小球足細(xì)胞下大量電子致密物沉積（藍(lán)色箭頭所示），足突彌漫性融合；NAC治療組與之比較，足細(xì)胞下電子致密物沉積都顯著減輕。NAC1組和NAC2組比較，上述各種病理損傷程度均無明顯差異。

圖1 各組大鼠24 h UTP、BUN、Scr、ALB水平Fig.1 The level of 24 h UTP、BUN、Scr、ALB

圖2 第4周末各組大鼠腎臟組織病理改變Fig.2 Pathological changes in kidney at the end of the 4th week

2.3 NAC治療減少MN大鼠腎臟固有細(xì)胞凋亡與正常組比較，模型組從第1周末開始，腎臟固有細(xì)胞凋亡增加（P＜0.05）。與模型組比較，NAC治療組從第3周末開始腎臟固有細(xì)胞凋亡顯著減少（P＜0.05）。NAC1組和NAC2組，腎臟固有細(xì)胞凋亡差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3，表1。

圖3 第4周末各組大鼠腎臟TUNEL染色（400×）Fig.3 TUNEL staining of kidney at the end of the 4th week（400 ×）

表1 不同時間點各組腎臟固有細(xì)胞凋亡指數(shù)Tab.1 The index of renal apoptosis in each group at different time points ±s

表1 不同時間點各組腎臟固有細(xì)胞凋亡指數(shù)Tab.1 The index of renal apoptosis in each group at different time points ±s

注：Control，正常組；MN，膜性腎病組；NAC1，N-乙酰半胱氨酸100 mg/kg治療組；NAC2，N-乙酰半胱氨酸200 mg/kg治療組；與同期Control組比較，*P＜0.05；與同期MN組比較，▲P＜0.05

時間第1周第2周第3周第4周Control組0.521±0.192 0.533±0.183 0.556±0.252 0.543±0.154 MN組1.440±0.243*2.901±0.874*4.052±0.912*5.253±1.503*NAC1組1.363±0.254*2.600±0.794*3.216±0.872*▲3.432±0.964*▲NAC2組1.294±0.321*2.283±0.820*3.061 ± 0.872*▲3.271 ± 1.141*▲

2.4 各組大鼠腎組織WT?1、GRP78、TRAF2、Caspase12蛋白動態(tài)表達(dá) 與正常組相比，從第1周末開始，模型組腎組織GRP78、TRAF2、Caspase12蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.05），WT-1蛋白表達(dá)顯著減少（P＜0.05）。與模型組比較，NAC治療組從第3周末開始，腎組織中GRP78、TRAF2、Caspase12蛋白表達(dá)較少（P＜0.05），WT-1蛋白表達(dá)較多（P＜0.05）。與NAC1組比較，NAC2組GRP78、TRAF2、Caspase12蛋白表達(dá)較少，WT-1蛋白表達(dá)較多，但各時間點二者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖4。

表2 不同時間點各組大鼠腎組織WT-1、GRP78、TRAF2、Caspase12蛋白相對表達(dá)Tab.2 Protein relative expression of WT-1、GRP78、TRAF2、Caspase12 in kidney at different time points x±s

表2 不同時間點各組大鼠腎組織WT-1、GRP78、TRAF2、Caspase12蛋白相對表達(dá)Tab.2 Protein relative expression of WT-1、GRP78、TRAF2、Caspase12 in kidney at different time points x±s

注：Control，正常組；MN，膜性腎病組；NAC1，N-乙酰半胱氨酸100 mg/kg治療組；NAC2，N-乙酰半胱氨酸200 mg/kg治療組；與同期Control組比較，*P＜0.05；與同期MN組比較，▲P＜0.05

Caspase12 0.003±0.001 0.017±0.004*0.014±0.008*0.015±0.004*0.006±0.002 0.047±0.010*0.038±0.008*0.036±0.009*0.004±0.003 0.077±0.012*0.037±0.011*▲0.033±0.009*▲0.007±0.002 0.142±0.004*0.067±0.011*▲0.051±0.021*▲時間第1周第2周第3周第4周組別Control組MN組NAC1組NAC2組Control組MN組NAC1組NAC2組Control組MN組NAC1組NAC2組Control組MN組NAC1組NAC2組WT-1 31.990±2.501 23.030±2.070*26.791±3.781*26.352±3.213*30.593±2.251 22.862±3.993*23.442±3.441*24.573±3.562*29.794±3.851 15.793±3.322*21.104±4.351*▲22.844±6.382*▲29.454±3.563 7.343±2.523*16.612±2.043*▲17.883±5.354*▲GRP78 0.003±0.001 0.011±0.004*0.009±0.002*0.008±0.002*0.006±0.004 0.021±0.005*0.018±0.003*0.017±0.004*0.007±0.002 0.031±0.005*0.026±0.005*▲0.025±0.004*▲0.005±0.002 0.039±0.005*0.028±0.004*▲0.027±0.006*▲TRAF2 0.002±0.001 0.006±0.001*0.004±0.001*0.005±0.002*0.008±0.005 0.017±0.004*0.015±0.003*0.016±0.002*0.007±0.002 0.025±0.007*0.019±0.004*▲0.018±0.005*▲0.005±0.003 0.041±0.008*0.029±0.007*▲0.027±0.004*▲

圖4 各組大鼠WT-1、GRP78、TRAF2、Caspase12免疫組化（400 ×）Fig.4 Immunohistochemical staining charts of WT-1，GRP78，TRAF2 and Caspase 12

2.5 各組大鼠血漿SOD、MDA的動態(tài)表達(dá)與正常組相比，從第2周末開始，模型組血漿SOD降低（P＜0.05），血漿MDA升高（P＜0.05）。與模型組比較，NAC治療組從第3周末開始，血漿SOD相對較高（P＜0.05），血漿MDA相對較低（P＜0.05）。NAC1組和NAC2組比較，各項指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖5。

圖5 各組大鼠血漿SOD、MDA動態(tài)表達(dá)Fig.5 Dynamic expression of plasma SOD and MDA

3 討論

MN是成人腎病綜合征最常見的病理類型之一，約50%的患者可在10～20年內(nèi)發(fā)展為終末期腎病，嚴(yán)重威脅人類健康。糖皮質(zhì)激素聯(lián)合免疫抑制劑雖然可以獲得約80%的緩解率，但副作用比較大，有時甚至?xí)＜盎颊叩纳踩Ｒ虼耍壳暗膰H指南建議，使用免疫抑制劑前應(yīng)有半年臨床觀察期，期間選用血管緊張素Ⅱ的拮抗藥物，雖然避免了免疫抑制劑的副作用，但患者大多會經(jīng)歷更漫長的腎病癥狀。為此，階段探索其他類型的有效藥物，更好地向臨床轉(zhuǎn)化，減輕患者的病痛，具有現(xiàn)實價值。

當(dāng)機體受到嚴(yán)重?fù)p傷，氧化應(yīng)激將普遍參與其中，而在細(xì)胞水平，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激也是細(xì)胞生理功能紊亂的典型反應(yīng)之一，同時反過來加重對細(xì)胞的病理損害。以往的研究者已在體外培養(yǎng)的各種腎臟細(xì)胞及多種動物模型中，報道了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化應(yīng)激參與腎臟疾病的發(fā)生與進(jìn)展［15-17］。本研究首次利用陽離子化牛血清白蛋白誘導(dǎo)的大鼠MN模型，較為系統(tǒng)地觀察了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與氧化應(yīng)激的作用，觀察到隨著MN模型的進(jìn)展，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志性蛋白GRP78表達(dá)增多，激活了它誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的主要途徑之一的TRAF2蛋白的表達(dá)，并進(jìn)而導(dǎo)致下游的Caspase12蛋白增加。而Caspase12可以引起胞漿內(nèi)鈣離子失衡，最終使細(xì)胞凋亡［18-20］。本研究也進(jìn)一步觀察到模型組腎臟固有細(xì)胞凋亡比例明顯增加，通過WT-1免疫組化染色證實足細(xì)胞數(shù)量減少，即可能源于凋亡。本研究還設(shè)計了用抗氧化藥物NAC拮抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，觀察是否能起到腎臟保護(hù)的作用，發(fā)現(xiàn)其對上述變化的反方向調(diào)節(jié)作用，表明NAC能通過降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減少腎小球固有細(xì)胞凋亡（特別是足細(xì)胞的凋亡）起到降低蛋白尿、保護(hù)腎功能的作用。同時，本研究還觀測到模型組大鼠，血漿SOD下降、MDA升高，提示存在全身的氧化應(yīng)激狀態(tài)，NAC治療組上述變化較輕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。說明NAC同時還可能通過拮抗全身的氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而降低被牛血清白蛋白誘導(dǎo)的異常自身免疫，使得致病的IgG在腎小球內(nèi)沉積減少，而起到減輕腎病的作用。這正與本研究中免疫病理觀測到的現(xiàn)象相一致。本研究中，NAC1組和NAC2組使用的劑量分別是100和200 mg/kg，相當(dāng)于人體使用劑量的5和10倍，符合動物藥理研究的一般原則，兩組間的腎臟保護(hù)作用沒有顯著差別，說明這個劑量范圍內(nèi)都具有療效，但需要在今后的研究中擴大劑量范圍以進(jìn)一步明確量效關(guān)系。另外，本實驗采用陽離子化牛血清白蛋白誘導(dǎo)的大鼠MN模型原因是除了成模率高、模型穩(wěn)定外，更主要的是考慮到MN病因多種多樣，目前沒有與人類MN相同的模型，而近年來有報道在部分兒童MN中發(fā)現(xiàn)牛血清白蛋白是致病抗原，可能源于腸道屏障功能異常導(dǎo)致牛奶中此類蛋白進(jìn)入人體致病［21］。因此，這一模型能更真實地模仿這一情況，為臨床篩選有效的藥物提供方便有效的平臺。本研究選做研究干預(yù)的藥物NAC作為化痰藥已在臨床廣泛使用，只是未作為抗氧化藥物用于腎臟病的治療，本研究的這一初步的新發(fā)現(xiàn)可以作為參考，為今后設(shè)計臨床試驗打下基礎(chǔ)，更好地為實現(xiàn)目前國家的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)戰(zhàn)略服務(wù)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，在陽離子化牛血清白蛋白的誘導(dǎo)的MN大鼠模型中，有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化應(yīng)激的參與；NAC通過對抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減少腎臟固有細(xì)胞凋亡及全身氧化應(yīng)激降低異常免疫起到降低尿蛋白、改善腎功能、延緩進(jìn)展的腎臟保護(hù)作用。NAC為代表的抗氧化劑有望成為輔助治療并延緩MN進(jìn)展的一種新的臨床治療策略。