胱硫醚-β-合成酶參與慢性壓迫性損傷大鼠神經病理性痛的作用

李清梅 張琴 秦榜勇 代韻柯 李雪

遵義醫學院附屬醫院麻醉科（貴州遵義563000）

外周神經損傷后的神經病理性疼痛是臨床上常見的疼痛。以往研究均表明背根神經節（dorsal root ganglia，DRG）對疼痛刺激產生興奮信號，再將信號傳入中樞神經系統致疼痛的增敏反應［1-2］，是痛覺信號傳入的初級神經元。硫化氫（H2S）是一種具有神經活性物質的氣體信號分子，內源性H2S合成酶胱硫醚-β-合成酶（CBS）廣泛參與慢性內臟痛、炎癥以及神經病理性疼痛的過程［3-5］。核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）廣泛存在于神經細胞和神經膠質細胞，是多種基因表達調控的關鍵性轉錄因子，在神經病理性疼痛中也起著重要的作用［6-7］。但在慢性神經損傷過程中CBS如何參與神經病理性疼痛及其與NF-κB的關系，報道較少。筆者擬通過觀察CBS抑制劑AOAA對CCI模型大鼠背根節CBS、NF-κB蛋白表達的影響，探討慢性坐骨神經損傷CCI模型中背根神經節CBS的作用及其與NF-κB的關系。

1 材料與方法

1.1 動物分組成功鞘內置管的雄性SD大鼠36只，體質量180～200 g，5～6周齡，本實驗嚴格按照國家疼痛學會倫理綱要進行操作。采用隨機數字表法分為3組（n=12）：CBS抑制劑AOAA組（CCI+AOAA組）、神經病理性痛組（CCI組）及假手術組（Sham組）。術后1 d開始連續給藥連續14 d（1次/d），同一時間給藥，CCI+AOAA組鞘內注射CBS抑制劑AOAA（Sigma公司）10 μg/kg 10 μL+ 生理鹽水10 μL，CCI組鞘內注射等量的生理鹽水。

1.2 鞘內置管腹腔注射水合氯醛（300 mg/kg）麻醉，固定，備皮，消毒，沿L5-6間隙作約2 cm長的切口，充分暴露棘突間隙，將無菌的PE-10導管經棘突間隙向頭端置入2 ～ 3 cm，參照文獻［8］，腦脊液溢出后封閉導管，固定在頸背后皮下，縫合傷口。

1.3 建立大鼠神經病理性痛模型建立大鼠神經病理性痛模型參照文獻［9］。麻醉固定后，暴露股骨后右側坐骨神經干，間隔1 mm松扎4處，結扎強度以引起小腿肌肉微顫為宜。

1.4 痛閾的測定于術前1 d和術后1、3、7、10、14 d鞘內給藥后30 min時隨機取6只大鼠測定。熱痛閾（TWL）：TF2-光熱測痛儀測定。機械痛閾：2390系列電子von Frey測定。

1.5 Westernblot法檢測脊髓背根神經節CBS和NF?κBp65的表達水平 取出術側L4～6背根神經節組織，立即放入液氮中冷凍保存，檢測蛋白表達水平。

1.6 統計學方法SPSS 19.0軟件分析，計量資料正態分布的以（）表示，采用單因素方差分析組間比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 機械痛、熱痛閾值比較與Sham組比較，CCI組術后各時點熱痛閾縮短，機械痛閾降低（P＜0.05）；與CCI組比較，CCI+AOAA組術后各時點熱痛閾延長、機械痛閾升高（P＜0.05）（表1、2，圖1、2）。

表1 各組大鼠熱痛閾不同時點的比較（n=6）Tab.1 Comparison of thermal withdraw latency of rats at different time in every group x±s

表1 各組大鼠熱痛閾不同時點的比較（n=6）Tab.1 Comparison of thermal withdraw latency of rats at different time in every group x±s

注：與Sham組相比，#P＜0.05；與CCI組相比，*P＜0.05

組別Sham組CCI組CCI+AOAA組術前1 d 24.0±2.4 24.1±1.9 24.1±1.9術后1 d 23.9±2.0 11.4±1.8#15.7±1.3*術后3 d 24.1±1.7 11.9±1.9#18.0±2.1*術后7 d 24.2±1.7 12.4±1.1#19.4±1.6*術后10 d 24.2±1.7 12.4±1.1#19.4±1.5*術后14 d 24.2±1.8 11.8±1.8#19.5±1.4*

表2 3組大鼠機械痛閾不同時點的比較（n=6）Tab.2 Comparison of mechanical withdrawal threshold of rats at different time in three group x±s

表2 3組大鼠機械痛閾不同時點的比較（n=6）Tab.2 Comparison of mechanical withdrawal threshold of rats at different time in three group x±s

注：與Sham組相比，#P＜0.05；與CCI組相比，*P＜0.05

組別Sham組CCI組CCI+AOAA組術前1 d 33.7±1.2 33.5±1.4 33.5±2.7術后1 d 33.9±2.1 19.8±1.4#24.2±2.6*術后3 d 33.6±2.4 18.3±1.2#23.8±3.2*術后7 d 33.7±2.3 17.7±2.1#24.6±2.2*術后10 d 33.3±1.9 18.0±2.0#25.9±1.8*術后14 d 35.2±1.2 13.9±3.2#26.2±2.1*

2.2 背根神經節CBS和NF?κBp65的表達 與Sham組比較，CCI組術后7和14 d時CBS及NF-κB p65表達上調（P＜0.05）；與CCI組比較，CCI+AOAA組術后7和14 d時NF-κB p65及CBS表達均下調（P＜ 0.05）（表3、圖3）。

3 討論

神經病理性疼痛臨床表現為異常痛，痛覺過敏和自發痛等，其發病機制不清。CCI模型是一種經典的疼痛模型，可產生明顯的機械異常痛和熱痛敏［10］。本研究中CCI大鼠均表現出明顯的機械閾值和熱刺激閾值降低，提示CCI大鼠模型制備成功。

圖1 大鼠熱縮足潛伏期閾值不同時間點的變化（n=6）Fig.1 Comparison of thermal withdraw latency of rats at different time

表3 各組大鼠背根神經節NF-κB p65和CBS表達的比較（n=6）Tab.3 Comparison of the expression of CBS and NF-κB p65 in rat dorsal root ganglia at different time in every group x±s

表3 各組大鼠背根神經節NF-κB p65和CBS表達的比較（n=6）Tab.3 Comparison of the expression of CBS and NF-κB p65 in rat dorsal root ganglia at different time in every group x±s

注：與Sham組比較，#P＜0.05；與CCI組比較，*P＜0.05

組別Sham組CCI組CCI+AOAA組CBS術后7 d 0.457±0.222 0.775±0.051#0.425±0.061*術后14 d 0.536±0.044 0.703±0.067#0.349±0.084*NF-κBp65術后7 d 0.517±0.041 0.830±0.046#0.405±0.028*術后14 d 0.549±0.083 0.745±0.054#0.264±0.056*

圖3 鞘內注射AOAA對CCI大鼠脊髓背根神經節CBS及NF-κBp65表達影響Fig.3 Western Blot showed the expression of CBS and NF-κB p65 in rat dorsal root ganglia at different time in three group

圖2 大鼠機械縮足閾值不同時間點的變化（n=6）Fig.2 Comparison of mechanical withdrawal threshold of rats at different time in three group.

H2S是一種無色、具有臭雞蛋氣味的有毒氣體，內源性H2S合成酶CBS大多表達在背根神經節、脊髓、大腦等神經組織中［11-12］。研究報道CBS的上調在慢性疼痛所致的痛覺過敏中起著重要作用［13-15］。本研究結果表明，CCI組背根神經節CBS的表達較Sham組上調，鞘內注射CBS抑制劑AOAA可減輕大鼠神經病理性痛，提示CBS參與了大鼠神經病理性痛的形成和維持。

NF-κB是位于細胞質中以p50/p65異二聚體為形式的一種快反應轉錄因子，與抑制性蛋白（inhibitor kappa B，IkB）結合而呈非活性狀態，被激活后，IkB解離，暴露出p50亞基上的易位信號和p65亞基上的DNA結合位點，使異二聚物表現出NF-κB的活性，被認為是控制早期基因表達的基因開關。本實驗給予鞘內注射AOAA后，CCI術后各時點TWL及MWT升高，術后7和14 d時NF-κB p65表達下調，提示大鼠神經病理性痛形成與背根神經節CBS的上調，進一步促進了NF-κB活化。這可能與CCI模型中DRG細胞中H2S產生增加，進一步增加細胞內氧化還原狀態來激活NF-κB，增強了的NF-κB活化［16］有關，從而參與神經病理性疼痛的形成。

綜上所述，大鼠神經病理性痛形成與背根神經節CBS的表達上調，促進NF-κB活化有關。特異性阻斷CBS信號通路和以NF-κB為靶點的治療可能為慢性疼痛的治療提供新的思路。