超聲引導下前列腺穿刺病理標本免疫學指標與前列腺癌相關性

賴己創 曾寶輝 陳佳琳 郭順華 過新民

暨南大學醫學院附屬廣州紅十字會醫院超聲診斷科（廣州510220）

前列腺癌（prostate cancer，PCa）的發病率在世界范圍內所有男性惡性腫瘤中已位居第二，嚴重危害著男性的健康與生命［1-2］。經直腸超聲引導下前列腺穿刺活檢技術在臨床的廣泛應用，大大提高了前列腺癌的檢出率。病理學診斷前列腺癌，主要是觀察其腺泡結構及形態，是否有紊亂、異形性或浸潤性的生長方式［3-4］。光鏡下所見高分化的前列腺腺癌，組織學形態與良性病變極其相似，較難鑒別，易發生誤診及漏診，通過免疫組化技術，有助于提高診斷準確率［5］。本研究通過對前列腺穿刺病理標本檢測，分析免疫組化指標P504s，CK-h，p63，S-100與前列腺癌診斷的相關性；并通過結合TCGA數據庫，分析數據庫中的樣本，驗證臨床樣本檢測的結論，分析檢測指標對病人預后的影響，完善隨訪信息。

1 材料與方法

1.1 材料（1）收集廣州市紅十字會醫院2012年7月至2016年8月前列腺穿刺病理標本，共238例（PCa 82例，非PCa 156例），所收集的病例均為男性，分析前列腺癌組與非前列腺癌組P504s，CK-h，p63，S-100的表達特點。（2）本文采用的TCGA公共數據庫包含了30余種腫瘤的測序和臨床數據，是由美國 National Cancer Institute（NCI）和 National Human Genome Research Institute（NHGRI）于 2006年聯合啟動的項目。其中TCGA前列腺癌數據庫包含了498例原發性前列腺癌，數據庫的全部內容可經由以下網址進行下載：http：//www.cbioportal.org/study?id=prad_tcga#summary。

1.2 方法

1.2.1 標本送病理及免疫檢測采用SP（streptavidin-perosidase）法，檢測試劑盒采用生物素標記的第二抗體與鏈霉菌抗生素蛋白連接的過氧化物酶及底物色素混合液來測定組織和細胞中的抗原?？贵w包括兔抗人P504s單克隆抗體（13H4），小鼠抗人CK-h單克隆抗體（34bE12），DAK-p63抗體，兔抗人S-100多克隆抗體，生產商均是Dako。染色步驟如下：（1）石蠟切片脫蠟、水化、自來水沖洗；（2）根據第一抗體的要求，對組織進行相應的抗原修復；（3）除去磷酸緩沖鹽溶液（PBS），切片上滴加過氧化物酶阻斷試劑，室溫下孵育10 min，PBS沖洗3次，每次3 min；（4）除去PBS，切片上滴加動物非免疫血清，室溫下孵育10 min；（5）除去血清，切片上滴加第一抗體，室溫下孵育60 min或4℃過夜，PBS沖洗3次，每次3 min；（6）除去PBS，切片上滴加生物素標記的第二抗體，室溫下孵育10分鐘，PBS沖洗3次，每次3 min；（7）除去PBS，切片上滴加鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶試劑，室溫下孵育10 min，PBS沖洗3次，每次3 min；（8）除去PBS，切片上滴加新鮮配制的DAB或AEC顯色試劑顯色；（9）自來水沖洗終止顯色，蘇木素復染，（如有必要可用1%鹽酸乙醇分化），PBS返藍。如果用DAB顯色，則切片經梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，如果用AEC顯色，則切片不能經乙醇脫水，而直接用水性封固及封固。

1.2.2 TCGA數據庫分析選取p63及S-100查詢TCGA數據庫，結合TCGA數據庫相關數據分析p63及S-100表達與前列腺癌患者預后的關系。

1.3 統計學方法比較各免疫指標在前列腺癌的表達率（%），采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異具有統計學意義。分析p63及S-100與前列腺癌的相關性，利用Kaplan-Meier統計學方法分析p63及S-100表達與前列腺癌生存率的關系分析，利用Cox回歸統計學方法分析p63及S-100表達與前列腺癌總體預后關系的分析。

2 結果

2.1 免疫組化檢測P504s，CK-h，p63，S-100在前列腺穿刺病理標本中的表達水平見表1。P504s在前列腺癌組的陽性表達率明顯高于非前列腺癌組，p63及CK-h在非前列腺癌組的陽性表達率明顯高于前列腺癌組。前列腺癌組及前列腺增生病例的病理對比見圖1。

表1 各免疫指標在前列腺癌的表達率Tab.1 The expression rate of immune indices in prostate cancer

圖1 免疫組化顯示P504s、P63及CK-h在前列腺癌及前列腺增生的表達（×40）Fig.1 Expression of P504s，P63 and CK-h in prostate cancer and benign prostatic hyperplasia

2.2 p63表達水平與前列腺癌病理特征及其預后的關系

2.2.1 p63在前列腺癌組織中低表達p63在前列腺癌組織的表達較在正常前列腺組織的表達顯著下調，差異有統計學意義（P＜0.05，圖2）。

圖2 p63在前列腺癌和正常前列腺組織中的表達Fig.2 p63 expression in prostate cancer and normal prostate tissue

2.2.2 p63表達水平與前列腺癌臨床特征的關系通過對TCGA數據庫分析，p63表達水平與前列腺癌臨床特征的關系見表2。

表2 p63表達水平與前列腺癌臨床特征的關系Tab.2 Relationship between p63 expression level and clinical features of PCa 例

2.2.3 p63表達水平與前列腺癌預后的相關性通過對TCGA數據庫分析，p63表達水平與前列腺癌預后的相關性見圖3。S-100蛋白診斷價值的Cox比例風險回歸，見表3。

圖3 p63與前列腺癌預后的關系Fig.3 Relationship between p63 and prognosis of prostate cancer

表3 p63診斷價值的Cox比例風險回歸Tab.3 Prognostic value of p63 expression for the survival by Cox proportional hazards model

2.3 S?100表達水平與前列腺癌病理特征及其預后的關系

2.3.1 S?100在前列腺癌組織中低表達S-100在前列腺癌組織的表達較在正常前列腺組織的表達顯著下調，差異有統計學意義（P＜0.05，圖4）。

2.3.2 S?100表達水平與前列腺癌臨床特征通過對TCGA數據庫分析，S-100表達水平與前列腺癌臨床特征的關系見表4。

2.3.3 S?100表達水平與前列腺癌預后的相關性通過對TCGA數據庫分析，S-100表達水平與前列腺癌預后的相關性見圖5。S-100蛋白診斷價值的Cox比例風險回歸，見表5。

3 討論

圖4 S-100蛋白在前列腺癌和正常前列腺組織的表達Fig.4 S-100 protein expression in prostate cancer and normal prostate tissue

表4 S-100表達水平與前列腺癌臨床特征的關系Tab.4 Relationship between S-100 expression level and clinical features of PCa 例

圖5 S-100蛋白與前列腺癌預后的關系Fig.5 Relationship betweenS-100 and prognosis of prostate cancer

表5 S-100蛋白診斷價值的Cox比例風險回歸Tab.5 Prognostic value of S100B expression for the survival by Cox proportional hazards model

前列腺癌作為我國男性最常見的惡性腫瘤之一，極大地危害了人類的健康，早期階段無明顯特殊癥狀，難以與前列腺增生等疾病鑒別，被診斷時多已發展為中晚期，錯過最佳手術時期［6-7］。因此，早發現、早治療對提高前列腺癌患者的預后具有重要作用［8］。 本研究中，P504s作為前列腺癌的標記物，有較高的敏感性（96.34%）和特異性（87.81%），這與國內的研究報道一致［9-10］。p63與CK-h在非前列腺癌均呈陽性表達，S-100僅有5例，在前列腺癌的表達率80%。因樣本量較少，故通過結合分析TCGA數據庫，驗證臨床樣本檢測的結論，完善隨訪信息。

經數據統計分析，S-100高表達相對于低表達危害比為0.540（P＜0.05），S-100的高表達是前列腺癌無病生存的保護性因素。p63高表達相對于低表達危害比為0.556（P＜0.05），p63的高表達是前列腺癌無生化復發生存的保護性因素。

目前超聲引導下前列腺穿刺活檢診斷前列腺癌的金標準［11］，但是高分化的前列腺腺癌，組織學形態與良性病變極其相似，僅憑光鏡所見較難鑒別，易發生誤診，通過免疫組化技術，有助于提高診斷正確率。本研究發現P504s作為前列腺癌標記物具有較高的敏感度與特異度，p63與CK-h在非前列腺癌中的高表達可應用于與前列腺癌的鑒別診斷；免疫指標的聯合應用將有望有效提高前列腺穿刺活檢的病理診斷準確性。

P504s基因又稱α-甲?；o酶A-消旋酶，定位于5p13，全長1 621 bp，存在于線粒體和過氧化物酶體中，參與支鏈脂肪酸及脂肪酸衍生物的β氧化。大量研究發現P504s的表達與前列腺癌具有明顯的相關性［12］，P504s在前列腺癌組織的表達顯著高于良性前列腺組織；有研究發現P504s的高表達與前列腺癌的生物學行為有關，高表達可能提示惡性程度越高及不良預后，可作為前列腺癌的輔助診斷指標［13］。P504s在前列腺癌中的陽性表達率可達80%～100%，前列腺癌中的P504s免疫組化染色在低倍鏡下就可與正常組織區分。在本研究中，82例前列腺癌患者中有79例檢測出陽性，陽性率達96.34%，與國內外大多數文獻報道相符合［14］。CK-h是高分子量角蛋白，作為基底細胞重要標志物，存在于前列腺腺體基底細胞中，高表達預示著基底細胞未被侵犯，有助于前列腺癌的診斷與分期。p63是一種核蛋白，與p53有同源性的基因編碼，在PCa的診斷意義與CK-h基本相同，而p63有時可標記CK-h陰性的基底細胞，因此兩者結合，可提高基底細胞的陽性率。

P504s可在血清中檢測，有研究表明，可利用血清中P504s對PCa進行篩查，可以減少不必要的有創檢查，如應用于臨床工作中，有望提供一個新的輔助診斷方法［15-16］。下一步研究將繼續收集病例，加強隨訪，探討免疫指標聯合應用與穿刺方案的相關性，以及穿刺術前相關指標血清學檢查，以期進一步提高前列腺癌早期診斷符合率。