不同因素對IVF實驗室試劑潛在胚胎毒性的影響

邱楓 饒金鵬

【摘要】 目的：探討體外受精（IVF）胚胎培養液分裝與否及開封時間長短對質量的影響，以降低因試劑不合理使用導致實驗室不良情況發生，進而降低不良妊娠結局發生率。方法：分別將待檢測的卵泡沖洗液、配子處理液、受精液、卵裂液、囊胚培養液取出1/2體積在無菌條件下分裝;余下1/2未分裝試劑同分裝試劑均于-4 ℃保存0、14、28 d。在0、14、28 d時，以質控合格的精子沖洗培養液為對照，分裝及未分裝試劑加或不加血清平衡過夜后進行精子存活試驗（human sperm motility assay，HSMA），72 h后計算并比較精子存活指數。結果：分裝及未分裝試劑精子存活指數均>0.85。分裝及未分裝試劑在同一時間點檢測，受精液精子存活指數均為最高，卵裂液精子存活指數均為最低。同一時間點檢測，分裝試劑精子存活指數均高于未分裝，差異均無統計學意義（P>0.05）。試劑在分裝及未分裝條件下檢測，0 d精子存活指數高于14、28 d，14 d精子存活指數高于28 d，差異均無統計學意義（P>0.05）。結論：分裝及未分裝試劑在開封后28 d內，雖均未表現出明顯的胚胎毒性，但精子存活指數隨放置時間增加均有下降趨勢。因此，試劑開封后28 d內應盡量縮短儲存時間。在相同時間點，分裝與否對潛在胚胎毒性均無明顯影響，但分裝可能會減少試劑的污染。因此，試劑未能一次性使用完畢應進行分裝。

【關鍵詞】 IVF實驗室試劑 胚胎毒性 精子存活試驗 分裝 開封時間

[Abstract] Objective： To investigate the effect of packaging and the opening time of IVF embryo culture solution on the quality， so as to reduce the occurrence of adverse laboratory conditions caused by irrational use of reagents， and then to reduce incidence of adverse pregnancy outcomes. Method： ASP， G-MOPS， G-IVF， G-1， G-2 to be tested were separately taken out of 1/2 volume and packed under sterile condition. The remaining 1/2 non-packed reagents and packed reagents were stored at -4 ℃ for 0， 14 and 28 days. At 0， 14 and 28 days， qualified HTF as the contrast， and the sperm motility assay was carried out through the packed reagents and non-packed reagents combined with serum balance after overnight. Sperm motility indexes were calculated and compared after 72 h. Result： The sperm motility indexes of packed and non-packed reagents were greater than 0.85. Packed reagents and non-packed reagents were tested at the same time， sperm motility indexes of G-IVF were the highest， and sperm motility indexes of G-1 were the lowest. At the same time， sperm motility indexes of packed reagents were higher than those of non-packed reagents， but the differences were not statistically significant （P>0.05）. The reagents were tested under the conditions of packed and non-packed， the sperm motility indexes at 0 d were higher than 14 and 28 d， and the sperm motility indexes at 14 d were higher than 28 d， but the differences were not statistically significant （P>0.05）. Conclusion： Although no significant embryotoxicity was observed in packed reagents and non-packed reagents within 28 days after opening， the sperm motility indexes tended to decrease with the increase of storage time， so the use time of reagents should be shortened as much as possible within 28 days after opening. At the same time， there was no significant effect on potential embryotoxicity between packed and non-packed. However， packed may reduce the contamination of reagents. Therefore， reagents should be packed if they can not be used at one time.

嚴格的實驗室質量控制與質量保障系統是配子和胚胎生長發育的必要條件，對維持IVF成功率具有重要作用[1-2]。在體外受精過程中，配子及胚胎對培養環境要求很高，培養液作為與配子及胚胎直接接觸的微環境，其成分、pH值、滲透壓及內毒素任何一項發生改變都可能影響配子及胚胎的正常發育，直接影響IVF妊娠率，甚至導致不良妊娠結局的出現。因此，培養液對配子及胚胎體外培養至關重要。人精子存活試驗（human sperm motility assay，HSMA）建立于20世紀80年代，可通過觀察精子活力變化檢測培養液是否存在胚胎毒性，尤其對低含量的毒性非常敏感，目前已被廣泛應用于臨床工作中質控新入庫試劑及耗材[3]。對于新建IVF實驗室，IVF周期數較少，培養液使用量小，導致試劑儲存時間延長，存在有效期內試劑過剩現象。在實驗室冰箱2 ℃～8 ℃儲存條件下，試劑是否分裝及開封時間長短對試劑胚胎毒性的影響尚缺乏考證。為了使試劑得到合理使用，減少浪費的同時避免因儲存時間過久、打開次數過多導致配子及胚胎異常發育，本研究通過HSMA比較IVF實驗室試劑分裝與否及開封時間長短對試劑潛在胚胎毒性的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 研究對象 36份精液標本均來自2019年1-7月于筆者所在醫院生殖醫學中心門診就診的健康生育男性，年齡20～35歲;否認酗酒、嗜煙、吸食大麻等不良嗜好;精液體積、精子濃度、總數、活動率等參數均正常（具體標準參照世界衛生組織精液分析第五版[4]）。

1.1.2 試驗試劑 精子密度梯度液（美國SAGE Pure Ception 40%，80%）、精子洗滌液（mHTF）、卵泡沖洗液（ASP）、配子處理液（G-MOPS）、受精液（G-IVF）、卵裂液（G-1）、囊胚培養液（G-2），均購自瑞典vitrolife公司。G-MOPS、G-IVF、G-1、G-2使用前按要求加入10%血清，除G-MOPS于前1 d配置，置于37 ℃培養箱外，其余培養液均于前1 d配置，置于37 ℃、6% CO2培養箱中培養過夜。將待檢測的ASP、G-MOPS、G-IVF、G-1、G-2取1/2體積在無菌條件下分裝，余下1/2未進行分裝。以質控合格的mHTF為對照。

1.1.3 耗材與設備 標準垂直凈化工作站（蘇州智凈 SW-CJ-1FD）、高速離心機（美國 THERMO SL16R）、相差顯微鏡（日本 OLYMPUS CX31）、恒溫培養箱（美國 THERMO3111）、Markler計數板（以色列 SELF-MEDICAL）、彩色精子質量檢測系統（北京偉力 WLJY-9000）、移液槍（eppendorf）;無菌取精杯、15 ml離心管、3 ml圓底試管、無菌移液管（美國BD Falcon公司）。

1.2 方法

1.2.1 精子存活試驗 待精液完全液化后，用精子質量檢測系統檢測精子各項參數。取15 ml離心管，將1 ml 80%的密度梯度液加入離心管底部，1 ml 40%的密度梯度液緩慢沿管壁加在80%的密度梯度液上層，兩液間有一清晰分層。平衡至室溫后，將精液緩慢沿管壁加在40%的密度梯度液液面上，以400 r/min離心20 min后去除上層精液及密度梯度混懸液（puresperm混懸液），加入5 ml已質控合格的mHTF，吹打混勻后以200 r/min離心5 min，丟棄上清液，重復洗滌兩次。沿管壁緩慢加入0.5 ml mHTF上游，30～40 min后，取出上層精子懸浮液，用Markler計數板計數后加入mHTF及待檢測培養液中，調精子終密度為5×106/ml。根據試劑要求置于通或不通37 ℃、6% CO2的培養箱中培養，每隔24小時混勻精子做精液分析，72 h后計算并比較精子存活指數。若精子存活指數>0.85說明試驗合格，否則表明該培養系統存在潛在胚胎毒性[5]。

1.2.2 分裝培養液 分別將待檢測ASP、G-MOPS、G-IVF、G-1、G-2取出1/2體積在無菌條件下分裝到質控合格的3 ml圓底試管，標記分裝試劑名稱、分裝時間及體積，并用封口膜封閉;余下1/2未分裝試劑同分裝試劑均于-4 ℃保存0、14、28 d，標記開封時間后用封口膜封閉。

1.3 觀察指標

在0、14、28 d時，以質控合格的mHTF為對照，以上5種分裝及未分裝試劑加或不加血清平衡過夜后進行HSMA，于72 h后在顯微鏡下計算質控合格的mHTF、5種分裝及未分裝試劑精子存活率，計算并比較精子存活指數。精子存活指數=5種分裝及未分裝試劑精子存活率/質控合格的mHTF精子存活率。

1.4 統計學處理

采用SPSS 19.0統計學軟件對數據進行統計分析，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗，計數資料以率（%）表示，采用字2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

5種分裝及未分裝試劑精子存活指數均>0.85，均合格。分裝及未分裝試劑在同一時間點檢測，G-IVF精子存活指數均為最高，G-1精子存活指數均為最低。同一時間點檢測，分裝試劑精子存活指數均高于未分裝試劑，差異均無統計學意義（P>0.05）。試劑在分裝及未分裝條件下檢測，0 d精子存活指數高于14、28 d，14 d精子存活指數高于28 d，差異均無統計學意義（P>0.05），見表1。

3 討論

人類輔助生殖技術包括體外受精、胚胎體外培養、胚胎移植等過程，這些過程均離不開胚胎培養液，質量穩定可靠的培養液直接關系到輔助生殖技術的每個過程，從而最終影響試管嬰兒妊娠率。目前使用的培養液都含有相對不穩定的成分，比如氨基酸和維生素等[3]。雖然IVF商品化試劑出廠前經過嚴格試劑質控，運輸過程亦使用標準冷鏈系統，但不同培養液、不同批號的同種培養液的質量都是有差別的。另外，季節性及供應途中保護措施不當均會影響培養液質量[6]。為確保試劑質量，試劑入庫前仍需經過實驗室嚴格質控[7-8]。常用的質控方法有化學質控和生物學質控，化學質控有pH檢測、滲透壓測定、內毒素測定;生物學質控方法有精子存活試驗、人類卵母細胞/胚胎培養法、小鼠胚胎生物檢測、體細胞增殖試驗[9-10]。人精子存活試驗取材方便經濟，對低含量的毒性成分十分敏感，常被應用于測定試劑質量和毒性工作中[9]。同時，人精子存活試驗能預測卵細胞的質量和受精結局，是一種價值較高的質控方法[11]。本研究通過人精子存活試驗對不同因素影響的IVF培養液進行檢測質控，結果顯示，本批次的培養液均質控合格。

IVF培養液的運輸和儲存均能影響其穩定性。IVF實驗室對于培養液的存放一般要求不改變培養液的性質，將細菌污染風險降到最低。一般情況下，微生物在10 ℃以下發育可被顯著抑制，故培養液一般儲存于2 ℃～8 ℃環境中，并且在使用時盡量縮短培養液暴露于室溫下的時間[12]。對于新建IVF實驗室，由于周期數少，試劑開封后可能會多次使用，隨著試劑使用頻率的增加，培養液在室溫下暴露的時間隨之增加。如果對培養液進行分裝可減少其在室溫下暴露時間，并減少開封次數，但也會增加IVF成本。本研究通過比較分裝與未分裝狀態下培養液在28 d內的質量，結果顯示，分裝與未分裝狀態下，在0、14、28 d時培養液均質控合格，且在同一時間點，分裝試劑精子存活指數與未分裝試劑精子存活指數比較，差異均無統計學意義（P>0.05），說明在28 d內分裝與未分裝試劑對培養液質量并無顯著影響。因此，各實驗室可按需求來決定分裝與不分裝試劑。但從細菌學角度來講，分裝試劑可在一定程度上減少試劑污染，建議新建IVF實驗室對試劑進行分裝，同時也可減少試劑浪費。

目前，商品化試劑均為含有氨基酸等各種成分的培養液，每種成分的儲存條件各不相同，如培養液中含有的青霉素、鏈霉素在水溶液中十分不穩定，隨著時間的延長，成分分解越多[5]。因此，儲存試劑不可能使每種成分達到最佳儲存狀態，相對不穩定的成分會在一定時間內較早失去其應有的性能。每種試劑都有相應保質期，但開封后分裝與未分裝試劑在儲存一定時間后是否質控合格尚未得知。本試驗通過比較開封后保存0、14、28 d相應試劑的精子存活指數，結果顯示，28 d內各種試劑的精子存活指數均在0.85以上，不同時間點精子存活指數比較，差異均無統計學意義（P>0.05），說明在28 d內培養液質量未受到明顯影響。但無論哪種試劑，隨著時間的延長，精子存活指數均呈下降趨勢，即培養液的質量呈下降趨勢。保存28 d仍在質控范圍內，故試劑開封后應盡快使用，根據每個實驗室周期數量及儲存條件不同，選擇合適的丟棄時間，以防影響實際應有的性能。本試驗尚存在一些不足，如未能檢測儲存更長時間的培養液質量。后期可在已有數據的基礎上根據本試驗的條件探究儲存更長時間的培養液質控如何，減少試劑浪費的同時降低胚胎毒性。

參考文獻

[1]黃國寧，劉東云，韓偉.輔助生殖技術實驗的建設及其質量控制[J].中國實用婦科與產科雜志，2010，26（10）：755-758.

[2] Saghooni N M，Amirian M，Sadeghi R，et al.Effectiveness of infertility counseling on pregnancy rate in infertile patients undergoing assisted reproductive technologies：a systematic review and meta-analysis[J].International Journal of Reproductive BioMedicine，2017，15（7）：391-402.

[3]黃國寧.輔助生殖實驗室技術[M].北京：人民衛生出版社，2014：131-133.

[4]世界衛生組織.世界衛生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊[M].第5版.北京：人民衛生出版社，2011：10-35.

[5]黃國寧，孫海翔.體外受精-胚胎移植實驗室技術[M].第1版.北京：人民衛生出版社，2012：35，228.

[6]趙濟華，曹云霞，周平，等.人精子存活試驗對輔助生殖技術實驗室質量控制的評價[J].中國婦幼保健雜志，2005，20（14）：1714-1716.

[7] Matson P L.Internal quality control and external quality assurance in IVF laboratory[J].Human Reproduction，1998，13（Suppl 4）：156-165.

[8] Gianaroli L.ESHRE guidelines for good practice in IVF laboratories[J].Human Reproduction，2000，15（10）：2241-2245.

[9] Claassens O E，Wehr J B，Harrison K L.Optimizing sensitivity of the human sperm motility assay for embryo toxicity testing[J].Human Reproduction，2000，15（7）：1586.

[10] Critchlow J D，Matson P L，Newman M C，et al.Quality control in an invitro fertilization laboratory use of human sperm survival studies[J].Human Reproduction，1989，4（5）：545-550.

[11] Hossain A M，Rizk B，et al.Human sperm bioassay has potential in evaluating the quality of cumulus-oocyte complexes[J].Archives of Andrology，1996，37（1）：7.

[12]孫丹丹，盧士玲，李開雄，等.貯藏溫度對冷鮮羊肉微生物菌群生長變化的影響[J].食品工業科技，2017，4（38）：327-331.

（收稿日期：2019-10-10） （本文編輯：李盈）