箭筈豌豆品種間遺傳差異的SSR分析及指紋圖譜構建

閔學陽，韋興燚，劉文獻，張正社，金小煜，NDAYAMBAZA Boniface，吳洪林，李昱，王彥榮

(蘭州大學草地農業生態系統國家重點實驗室,蘭州大學農業農村部草牧業創新重點實驗室,蘭州大學草地農業科技學院,甘肅 蘭州 730020)

遺傳育種材料來源的選擇，對農業生產、遺傳改良具有重要意義，另外，遺傳多樣性很大程度上決定了種質資源的豐富度，是物種適應外界環境和進化的前提；同時，遺傳多樣性研究能夠反映栽培物種的育種水平、發現新的基因資源和改良現有的育種材料[1-3]。近年來，隨著分子生物學的興起，DNA分子標記技術已被應用于植物分類、品種鑒定、指紋圖譜構建和遺傳多樣性分析等研究中[4-6]。其中，簡單重復序列(simple sequence repeats,SSR)分子標記具有共顯性、單堿基高分辨率、操作簡單、重復性好、可檢測等位基因和隨機均勻分布在擴增基因組內等優點，已成為植物雜交育種和種群遺傳多樣性等研究領域中最常用的分子標記之一[7-8]。因此，利用SSR分子標記技術分析物種遺傳差異，將為物種遺傳多樣性和分子標記輔助育種的研究奠定基礎。

箭筈豌豆(Viciasativa)作為一種重要的一年生、自花授粉、二倍體豆科牧草，具有生育周期短、較高的營養價值和經濟效益，同時具有固氮、改善土壤結構、廣泛的適應性和良好的抗寒能力，是一種優良的飼草和綠肥兼用牧草，在土耳其、中國、中亞、南美等地區普遍種植[9-11]。但目前對箭筈豌豆遺傳結構及群體多樣性的研究相對較少，分子標記數量十分有限，遠不能滿足箭筈豌豆遺傳多樣性研究與分子育種工作的需要。隨著測序技術的快速發展和成本的降低，基于轉錄組數據挖掘有價值的SSR位點已在多種植物中得到了成功驗證。

轉錄因子(transcription factors，TFs)是一類能夠直接或間接與基因啟動子區域中順式作用元件發生特異性作用，能夠激活或抑制下游被調控基因的轉錄[12-13]。隨著測序技術的發展和基因組學工具的開發使用，許多物種的轉錄因子已被鑒定和注釋。截至目前，已從高等植物中分離鑒定出100多個轉錄因子家族[14]。由于轉錄因子的可用性、連續富集和明確的功能域，可作為優異的候選基因用于開發基于基因功能的微衛星標記[6]。迄今為止，轉錄因子分子標記只在鷹嘴豆(Cicerarietinum)和蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)中被研究報道，并且這些標記已被證明在標記輔助遺傳改良和品種鑒定中具有很大的潛力[6,15]。

新《種子法》的實施明確規定，申請審定的農作物品種應具備特異性(distinctness)、一致性(uniformity)、穩定性(stability)簡稱DUS，DUS測試結果已成為農作物品種審定登記的必要條件。在農業農村部農業技術試驗示范(國家草品種區域試驗)項目的資助下，本團隊開展了箭筈豌豆品種的評價和測試分析試驗。為了從分子水平研究箭筈豌豆品種間基因型的差異，本研究采用基于箭筈豌豆轉錄組數據挖掘的轉錄因子SSR引物，利用30份箭筈豌豆品種構建品種指紋圖譜，并在此基礎上對品種間的遺傳相似性進行分析，從分子水平上為箭筈豌豆品種的鑒定和保護提供更加準確、公正和客觀的判定依據。同時印證基于箭筈豌豆轉錄組數據鑒定其轉錄因子，進而開發SSR標記的可行性，以期為箭筈豌豆遺傳多樣性分析、品種鑒定和指紋圖譜構建提供有價值的候選標記。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用的30個箭筈豌豆品種由國內和國外兩部分構成。其中，20份國外品種來源于美國農業部，10份國內品種來源于中國農業農村部全國畜牧總站和國家草種質資源庫(表 1)，上述箭筈豌豆品種均種植于蘭州大學榆中校區試驗站，實驗材料在2017年5月采集于榆中校區試驗田。

1.2 基因組DNA的提取

每個箭筈豌豆品種采集10個單株的新鮮葉片分別提取基因組DNA[6,16]。提取后的DNA經1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測質量，并用Nanodrop分光光度計測定DNA濃度和質量(OD260/OD280≈1.8)。將檢測合格的DNA樣品稀釋至50 μg·L-1，最后把同一品種的10份DNA稀釋液等體積混合，于-20 ℃保存備用。

1.3 轉錄因子和SSR位點鑒定及引物設計

用于鑒定箭筈豌豆轉錄因子和開發SSR分子標記的44582條箭筈豌豆 Unigene序列下載于NCBI Gene Expression Omnibus數據庫，登錄號為：No.GSE35437。豆科植物轉錄因子蛋白序列下載于豆科轉錄因子數據庫(legume transcription factor database, Legume TFDB)。利用本地BLAST程序(E-value=10-10)與箭筈豌豆Unigene進行比對，鑒定箭筈豌豆中潛在的轉錄因子基因。分別通過MicroSAtellite(MISA, http://pgrc.ipkgatersleben.de/misa/)工具和Primer 3軟件進行SSR位點識別和引物設計[17]。

表1 箭筈豌豆品種鑒定試驗材料Table 1 V. sativa cultivars in the experiment

注：品種類型均為育成品種。

Note: Variety types are cultivar.

1.4 功能注釋

將所獲得的箭筈豌豆轉錄因子中含SSR位點并且能夠成功設計引物的Unigene序列，通過Blast2GO[18]和WEGO軟件進行功能注釋[19]。

1.5 PCR擴增與檢測

引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。SSR-PCR擴增體系為10 μL，在Eppendorf Mastercycler nexus PCR儀(德國)上進行：2×Taq PCR MasterMix 5 μL，正反向引物各1 μL (10 μmol·L-1)，模板DNA 1 μL (50 ng·μL-1)，ddH2O 2 μL。PCR反應條件為：94 ℃變性30 s后，62～54 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸30 s，共8個循環；94 ℃變性30 s后，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共25個循環；72 ℃延伸7 min；于4 ℃保存。PCR擴增產物用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

1.6 數據分析

通過人工比對和軟件校正，對SSR 標記擴增產物進行統計。按照擴增條帶的分子量從大到小編號讀取，相同遷移位置有帶的記為1，無帶的記為0，建立“0，1”矩陣，并統計SSR標記擴增產物的總條帶數(total bands, TB)、預計雜合度(expected heterozygosity, He)和多態信息量(polymorphic information content, PIC)[20]。用Quantity One軟件根據marker分子量計算特異擴增條帶的分子量，通過Originpro 8軟件把“0，1”數據轉換為標準模式圖。

2 結果與分析

2.1 箭筈豌豆轉錄因子SSR分子標記開發

將箭筈豌豆Unigene序列與大豆(Glycinemax)、百脈根(Lotuscorniculatus)和蒺藜苜蓿的轉錄因子蛋白序列進行本地BLAST比對，得到34個潛在的箭筈豌豆轉錄因子家族，共1816個基因(表 2)。通過MISA軟件對Unigene進行SSR位點檢測，其中SSR位點對應重復的一、二、三、四、五和六核苷酸的最少重復次數分別為10、6、5、5、5、5；同時，兩個微衛星之間的距離小于100 bp時，組成一個復合微衛星。在282個Unigene中共檢測到306個SSR位點，采用Primer 3軟件進行引物設計，最終208對SSR引物在188個Unigene序列中成功設計。對檢測到的SSR位點的類型和分布進行統計分析(表 2)，SSR位點具有三堿基重復類型的數量最多，共121個，占SSR位點重復類型的58.17%；其次分別為單堿基重復類型(45，21.63%)、二堿基重復類型(24，11.54%)，無四、五和六堿基重復類型。

表2 箭筈豌豆SSR標記開發匯總Table 2 Summary of SSR search results for V. sativa

2.2 含有SSR位點的轉錄因子功能分類

使用Blast2GO和WEGO軟件對188個箭筈豌豆Unigene序列進行了功能注釋(圖1)。在本研究中，共有156(82.98%)條Unigenes得到了GO注釋，包括細胞組分(cellular component，110個)，分子功能(molecular function，147個)和生物學過程(biological process，117個)，所有的匹配序列被進一步富集為28個功能類別，細胞組分分類中，細胞和細胞成分功能類別中(cell and cell part)均注釋到109個轉錄因子序列，其次為細胞器(organelle，102個)。基于分子功能的分類將轉錄因子基因分為5組：蛋白結合(binding，133個)，轉錄調節活性(transcription regulator activity，54個)，催化活性(catalytic activity，13個)，轉運活性(transporter activity，2個)和結構分子活性(structural molecule activity，1個)。在生物過程分類中，兩個代表性最高的GO術語是細胞過程(cellular process，109個)和代謝過程(metabolic process，108個)，其次是生物調節和生物過程調節(biological regulation and regulation of biological process，均為101個)。

2.3 SSR產物多態性分析

用208對成功設計的SSR引物對30份箭筈豌豆品種進行遺傳多樣性分析(表3)，共鑒定得到35對可擴增出多態性高、穩定性好和譜帶清晰的引物(圖2)。每對引物的擴增帶數從3(VsTFSSR-10、-14、-16和-26)到18(VsTFSSR-24)不等，平均值為8.23。35對引物的多態性位點百分比均達到了100%；多態信息含量(PIC)范圍為 0.42(VsTFSSR-26)～1.00(VsTFSSR-01、-05和-08)，平均值為0.80；預計雜合度(He)范圍為0.53(VsTFSSR-26)～1.00(VsTFSSR-01、-05和-08)。

圖1 含有SSR位點的轉錄因子GO分類Fig.1 GO classifications of TFs genes containing SSR

引物編號 Primer ID重復序列 Motif引物序列 Primer sequence (5′-3′)目標條帶Product size (bp)總條帶數Totalbands預計雜合度He多態信息含量 PIC轉錄因子家族 Transcription factor familyVsTFSSR-01(ACA)6F:TCAAAACCTTAAACGCTCCGR:GGAACTATTGGATCGGGGTT23081.001.00ERFVsTFSSR-02(CTT)5F:TTCATCAGAACCACCAAAAGCR:CAAAATCCGGCGACTATGTT19440.980.98bHLHVsTFSSR-03(ATC)5F:TCCACCTTCTCTTTCAGATTCTCR:CCGTGAGTTTGATGACGATG27660.990.99G2-likeVsTFSSR-04(CAA)5F:GCAACGCAGAACTCTTTTCCR:TCCGTCTCGAAGCTCTTGTT14540.890.88TCPVsTFSSR-05(TTG)5F:TGGTTGGTAACGAGGGATGTR:CCTCAACAACTCGCCAATCT21391.001.00C2H2VsTFSSR-06(CAA)5F:ATGGCTCATCGTCATCATCAR:TGGTTTTGTGTTTGGGGATT199150.900.89MYBVsTFSSR-07(TGT)5F:TGTTTTCCACATGTTTGTGTCAR:CCACAAATCCACCAAGGTTT156110.850.83TALEVsTFSSR-08(CAT)6F:GAAATCAGTCTTCCAAACAACATR:TGGATTCCAAAGCTCTTTTCC13981.001.00G2-likeVsTFSSR-09(AAC)6F:TCCGAGGTCTGTTCAAAAGGR:ATTTTCCCACCGACACACAT157130.730.69ERFVsTFSSR-10(T)10F:AAAGAGGGTTTACGGTGGCTR:CCAAATCTTTTCTCTCCATTCC21230.890.89ERFVsTFSSR-11(CAT)5F:CCAAACAAACCATCTTTGCATR:AAACCCAAGAACCCCAACTC18240.930.93ERFVsTFSSR-12(GGT)6F:GGTTGAATTCATGCGATGTGR:GATCTATACGGCCGAGCAAC27040.670.61GRAS

續表3 Continued Table 3

圖2 部分VsTFSSR引物的擴增圖譜Fig.2 Amplification results by part of VsTFSSR primers A: VsTFSSR-12; B: VsTFSSR-19; C: VsTFSSR-22; D: VsTFSSR-23; E: VsTFSSR-26; F: VsTFSSR-28; G: VsTFSSR-31.

2.4 箭筈豌豆品種聚類分析

利用NTSYS-pc 2.10軟件的UPGMA法對30個箭筈豌豆品種進行聚類分析(圖3)，不同品種間的遺傳相似系數(Nei-Li/Dice系數)范圍為0.69～0.95，表明不同品種之間存在著豐富的遺傳多樣性。首先，30份箭筈豌豆品種被聚為兩大類：國內品種和國外品種，其中，蘭箭1號箭筈豌豆在聚類分析中與國外品種聚為一類，表明蘭箭1號箭筈豌豆相較于其他國內品種具有更為豐富的遺傳背景。根據聚類結構進一步將30個箭筈豌豆分為6個類群，其中A類群有5個品種，均來自前蘇聯；B類群共有5個品種，3個品種來自法國，1個來自美國，1個來自中國；C類群共有4個品種，3個來自匈牙利，1個來自日本；D類群共4個品種，3個來自美國，1個來自匈牙利；E類群共9個品種，均來自中國；F類群共3個品種，2個來自美國，1個來自匈牙利。 聚類分析結果表明，所選用的35對SSR引物具有很好的區分效果，可初步將不同地理起源的品種進行區分。

2.5 VsTFSSR引物鑒定箭筈豌豆品種效率分析

利用35對引物在30個箭筈豌豆品種的電泳帶型進行相關性分析，相關性分析結果如圖4所示。引物VsTFSSR-10與VsTFSSR-26、VsTFSSR-14與VsTFSSR-26之間相關性最強，相關系數為0.89，表明這兩對引物間擴增帶型差異最小；而VsTFSSR-9與VsTFSSR-24之間相關性最低，相關系數為-0.27，表明擴增帶型差異最大。不同引物間的相關性分析可進一步輔助在品種鑒定時進行引物間的優化組合，通過選取相關性較低的引物組合可以提高引物組合的鑒別效率。例如VsTFSSR-6能夠區分7個品種，VsTFSSR-18能夠區分5個品種，兩對引物間的相關性系數為0.28，兩對引物組合可以區分11個箭筈豌豆品種。

圖3 30份箭筈豌豆品種VsTFSSR引物聚類分析Fig.3 Dendrogram of 30 V. sativa cultivars based on VsTFSSR primers

圖4 35對VsTFSSR引物擴增結果相關性分析Fig.4 The correlation analyzes based on the 35 VsTFSSR primers amplification product 1～35表示引物VsTFSSR-01～VsTFSSR-35。1-35 indicated the primer ID from VsTFSSR-01 to VsTFSSR-35.

2.6 核心引物確定

在篩選出的35對VsTFSSR多態性引物中，每個箭筈豌豆品種至少在1對VsTFSSR引物中具有特異性條帶，即該品種可以用1對或1對以上的引物與其他所有箭筈豌豆品種進行區分(圖5)。例如引物VsTFSSR-24能擴增出18個多態性條帶，一次性可以區分19個品種；VsTFSSR-30擴增出13個多態性條帶，一次性可以區分15個品種；VsTFSSR-35擴增出15個多態性條帶，一次性可以區分12個品種。通過對引物擴增的特異性條帶數和不同引物間的相關性進行分析，確定利用6對引物(VsTFSSR-21、VsTFSSR-23、VsTFSSR-24、VsTFSSR-30、VsTFSSR-34和VsTFSSR-35)就可將所有的30個箭筈豌豆品種區分開，這6對引物可作為箭筈豌豆品種指紋圖譜構建的核心引物。以篩選出的6對核心引物擴增電泳圖譜為基礎，由 1和 0 組成的字串構成數字指紋，再經Originpro 8軟件轉換，建立了基于6對引物擴增的蘭箭1號、蘭箭2號和蘭箭3號品種標準模式圖(圖6)。根據每個品種的特異性帶型，可以比較容易地鑒定區分，如VsTFSSR-24、VsTFSSR-30和VsTFSSR-35中的一對引物就可以將上述3個品種完全區分開。

圖5 30個箭筈豌豆品種特異性識別引物數量Fig.5 The number of the VsTFSSR primers specifically identified in 30 V. sativa cultivars

圖6 基于6對核心引物擴增的3個箭筈豌豆品種指紋圖譜標準模式圖Fig.6 Mode image of fingerprintings for three V. sativa cultivars by six core primer pairsA: 蘭箭1號 Lanjian1; B: 蘭箭2號 Lanjian2; C: 蘭箭3號 Lanjian3.

2.7 箭筈豌豆品種指紋圖譜構建

統計6對核心引物在30個箭筈豌豆中擴增的1，0數據，將6對引物擴增結果組合在一起即為箭筈豌豆的DNA指紋圖譜。如用6對SSR引物擴增TYESISSKAYA品種，在6對引物中得到的圖譜分別為0000100、00000000100、000000000000000010、0100010000010、000001000和000000011001000，將其組合到一起為0000100-00000000100-000000000000000010-0100010000010-000001000-000000011001000(表 4)，得到由“0”和“1” 組成的73個數字圖譜。利用組合的數字圖譜構成了30個箭筈豌豆品種的組合指紋圖譜數據庫，當30條字符串形成能夠唯一標識的字符串時，即表明這6對VsTFSSR引物能將30份箭筈豌豆品種全部區分開，每一條字符串可以作為每一份箭筈豌豆的分子身份證號碼。

表4 30個箭筈豌豆品種的DNA指紋圖譜Table 4 DNA fingerprint of the 30 V. sativa cultivars

3 討論

相比其他類型的分子標記，SSR分子標記以其獨特優越性，從2005年起就被國際植物新品種保護聯盟(UPOV)推薦作為建庫優選的標記，因此在品種鑒定上具有較高的權威性[21-22]。隨著后基因組時代的到來，轉錄組測序技術已被廣泛用于研究模式和非模式植物的生長發育以及對逆境脅迫響應的機制研究[23-24]。通過轉錄組測序數據開發的 SSR 標記具有 EST-SSR 標記的優點，同時還可以提高植物遺傳多樣性分析的準確性。相對于其他豆科牧草，如苜蓿(Medicagosativa)、三葉草(Trifolium)、百脈根和草木樨(Melilotussuaveolens)等，目前對箭筈豌豆遺傳結構及群體多樣性的研究相對較少，分子標記數量十分有限，遠不能滿足箭筈豌豆遺傳多樣性研究與分子育種工作的需要。同時，傳統的形態學鑒定方法具有耗時長、需要專門的技術人員、易受環境條件限制、需要大量的土地面積等缺點。目前以PCR 技術為基礎的分子標記技術已被成功地運用于水稻(Oryzasativa)、茶樹(Camelliasinensis)、苜蓿和棉花(Gossypiumspp.)等植物的品種鑒定中[25-28]。

本研究首先通過生物信息學鑒定了箭筈豌豆 Unigene序列中潛在的轉錄因子，進而檢測了轉錄因子序列中的SSR位點，利用Primer 3軟件進行引物設計，成功獲得208對轉錄因子SSR引物，最終從208對SSR引物中篩選獲得35對條帶清楚、擴增效果穩定的多態性引物。研究表明當PIC值大于0.5可作為信息標記，當PIC值大于0.7可用于構建遺傳圖譜[29]。在本研究中，35對SSR引物的PIC平均值為0.80，除VsTFSSR-26(PIC=0.42)引物的PIC值小于0.5，其余引物的PIC值均大于0.5；其中27個(77.14%)引物的PIC值大于0.7，表明基于轉錄因子開發的多態性分子標記在箭筈豌豆遺傳多樣性和遺傳圖譜分析中具有較大的潛力。Kim等[30]對兩個箭筈豌豆亞種(V.sativassp.sativa和V.sativassp.nigra)進行轉錄組測序分析，在兩個亞種中分別選取100對引物，并分別在9個V.sativassp.sativa和 9個V.sativassp.nigra亞種中對開發的標記進行評價，PIC值為0.38～0.75，在兩個箭筈豌豆亞種中的平均PIC值分別為0.54 (sativa)和0.51 (nigra)；Chung等[31]利用高通量測序在箭筈豌豆中獲得17971條序列，從中鑒定得到2429個SSR位點，共設計并合成了100對cDNA-SSR引物。在32份箭筈豌豆材料中篩選出49對多態性引物，PIC的范圍為0.20～0.86，平均值為0.59；Liu 等[32]用96對EST-SSR引物在10個箭筈豌豆材料中進行擴增，PIC的范圍為-0.09～0.98，平均值為0.70；Liu等[6]在44個苜蓿品種中評估了27個多態性TFGM(transcription factor gene-derived microsatellite)分子標記，PIC值為0.08～0.84，平均值為0.60。而本研究篩選出的35對VsTFSSR引物在30個箭筈豌豆品種中的PIC平均值為0.80，均高于以上研究結果，表明VsTFSSR標記在箭筈豌豆遺傳多樣性分析中優于其他類型的SSR標記。

對引物擴增的特異性條帶數和不同引物間的相關性進行分析，確定了6對核心引物用于構建30個箭筈豌豆品種的DNA指紋圖譜。把6對SSR引物的擴增結果組合在一起就可以將30個箭筈豌豆品種完全區分開，即每個箭筈豌豆品種都有能夠唯一標識的一份品種字符串。目前UPOV已為箭筈豌豆制定了DUS測試指南，國內箭筈豌豆的DUS測試指南正在研制中，因此箭筈豌豆SSR引物的開發和指紋圖譜的構建可以為SSR標記技術在箭筈豌豆DUS測試中應用奠定基礎，在箭筈豌豆品種鑒定和知識產權保護等方面發揮積極作用，同時在育種策略調整和選配優良雜交組合培育新品種等方面具有現實意義。

4 結論

本研究利用箭筈豌豆 Unigene序列鑒定潛在的轉錄因子基因，設計開發SSR引物；并從中篩選獲得35對多態性引物，證明基于箭筈豌豆轉錄組數據鑒定其轉錄因子，進而開發SSR標記的可行性。最終用6對核心引物構建了30個箭筈豌豆品種的DNA指紋圖譜。本研究可以從分子水平快速準確鑒別和了解箭筈豌豆品種的遺傳差異，進而為合理利用箭筈豌豆種質資源提供理論依據。