CREB1對血管性癡呆大鼠認知功能障礙的 影響及機制研究*

方玲，楊莉莉

（1.杭州市第七人民醫院 精神三科，浙江 杭州 310013；2.安徽醫科大學，安徽 合肥 230601）

隨著血管性癡呆發病率的不斷升高，探討血管性癡呆的發病機制可為血管性癡呆的防治提供依據[1]。環腺苷酸反應成分結合蛋白1（cyclic adenylate response component binding protein 1,CREB1）在血管內皮化和血管內膜形成中具有重要作用[2]；在神經元應激性損傷后的修復、再生及存活中發揮重要調節作用。有研究發現，CREB1在抑郁癥患者中水平下降[3]。本文探討CREB1在血管性癡呆大鼠海馬組織中的表達，以及對認知功能的影響和機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物健康、清潔級、雌雄各半、體重270～290 g的SD大鼠40只[中國科學院微生物研究所，許可證號：SYXK（京）2014-0032]。

1.1.2 主要試劑CREB1過表達慢病毒載體和空載體病毒（美國Promega公司），兔抗大鼠CREB1多克隆抗體、兔抗鼠Caspase-3多克隆抗體、兔抗鼠Bcl-2多克隆抗體、兔抗鼠Bax多克隆抗體、兔抗鼠磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K）多克隆抗體、兔抗鼠磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B,p-PKB）多克隆抗體、兔抗鼠蛋白激酶B（protein kinase B,PKB）多克隆抗體、過氧化物酶標記的羊抗兔免疫球蛋白G及激動蛋白β（β-actin）抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及血管性癡呆模型的復制將40只大鼠根據隨機數字表法分為對照組（假手術組）、模型組（血管性癡呆組）、陰性對照組（血管性癡呆+空載體病毒處理組）及CREB1過表達組（血管性癡呆+CREB1過表達病毒處理組），每組10只。采用四血管阻斷法復制血管性癡呆模型[4]：將大鼠用水合氯醛麻醉成功后，在枕骨下做長1 cm水平切口，暴露大鼠第1頸椎和第1頸椎兩側橫突翼孔，用電凝針燒灼兩側椎動脈，造成椎動脈永久性閉塞，縫合切口。24 h后水合氯醛麻醉大鼠，組織剪剪開頸正中線長約1 cm切口，分離結締組織，找到頸總動脈，微血管夾夾閉頸總動脈15 min，再通10 min，共3次，縫合切口。對照組僅暴露血管，不進行椎動脈燒灼和頸總動脈夾閉。

1.2.2 大鼠處理4組大鼠模型復制成功后2 d，采用腦立體定位注射病毒載體[5]：4組大鼠水合氯醛麻醉成功后，固定到腦立體定位儀上，常規備皮消毒后，沿矢狀縫剪開頭部皮膚，以矢狀縫和人字縫交點為原點，按照腦立體定位儀圖譜，鉆開顱骨，垂直腦表面進針，CREB1過表達組大鼠5 min內緩慢注入2.5μl CREB1過表達載體病毒；陰性對照組大鼠5 min內緩慢注入等量空載體病毒；模型組和對照組5 min內緩慢注入等量生理鹽水。緩慢退針，縫合皮膚。

1.2.3 Morris水迷宮實驗4組大鼠處理后第2天進行水迷宮實驗，將直徑100 cm、高50 cm水池分成4個 象限，將圓柱形平臺放入水池中，實驗前將水池注水至淹沒水池平臺2 cm，水迷宮實驗分為定位航行試驗（共4 d）和空間探索試驗（第5天進行）。定位航行試驗：將水池中注水至高出平臺2 cm，水溫保持約25℃，將大鼠依次從各個象限放入水中進行訓練，每只大鼠每天上、下午分別訓練4次，1次/象限，8次/d，訓練2 min/次，大鼠找到平臺并在平臺上停留30 s。如2 min內沒有找到平臺，則引導其找到平臺并停留30 s，然后休息2 min再進行下一次訓練。大鼠找到平臺的時間為逃避潛伏期，取每只大鼠訓練的平均值。空間探索試驗：定位航行試驗結束后將水池中平臺去除，次日進行空間探索試驗，將大鼠放入水中，記錄大鼠穿越原平臺象限 次數。

1.2.4 曠場實驗取一個長47 cm×47 cm×40 cm的曠場，水迷宮實驗結束后，將大鼠放入曠場中心方格內，在曠場上方安置攝像機，記錄大鼠運動情況，記錄15 min內大鼠的活動次數和活動距離。

1.2.5 大鼠海馬組織CREB1、Caspase-3、Bcl-2、Bax、PI3K、p-PKB及PKB蛋白水平測定曠場實驗結束后，水合氯醛麻醉大鼠，快速斷頭，冰上取出大鼠腦組織海馬組織。采用Western blotting檢測大鼠海馬組織CREB1、Caspase-3、Bcl-2、Bax、PI3K、p-PKB及PKB蛋白水平：取大鼠海馬組織加入RIPA裂解液，勻漿后提取海馬組織總蛋白，測定蛋白濃度，經電泳、切膠及轉膜，加入一抗（1∶1 000）過夜孵育，加入二抗孵育2 h，以β-actin為內參照（1∶2 000），ECL發光液顯影。采用NIH1162軟件（美國國立衛生研究院）分析各蛋白條帶光密度值，目標蛋白水平為目標蛋白條帶光密度值/β-actin條帶光密度值。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 20.0統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學 意義。

2 結果

2.1 4組大鼠曠場實驗結果比較

4組大鼠曠場實驗活動次數比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）；模型組、陰性對照組及CREB1過表達組大鼠曠場實驗活動次數低于對照組（P＜0.05），CREB1過表達組大鼠曠場實驗活動次數高于模型組和陰性對照組（P＜0.05）。4組大鼠曠場實驗活動距離比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）；模型組、陰性對照組及CREB1過表達組大鼠曠場實驗活動距離短于對照組（P＜0.05），CREB1過表達組大鼠曠場實驗活動距離長于模型組和陰性對照組（P＜0.05）。見表1。

表1 4組大鼠曠場實驗結果比較（n=10，±s）

表1 4組大鼠曠場實驗結果比較（n=10，±s）

組別 活動次數（次/15 min）活動距離（m/15 min）對照組 223.42±25.46 12.14±1.15模型組 94.35±22.74 3.15±0.97陰性對照組 96.57±23.04 3.32±1.04 CREB1過表達組 165.26±24.37 7.58±1.13 F值 66.787 156.651 P值 0.000 0.000

2.2 4組大鼠水迷宮實驗結果比較

4組大鼠水迷宮實驗逃避潛伏期比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）；模型組、陰性對照組及CREB1過表達組大鼠逃避潛伏期長于對照組（P＜0.05），CREB1過表達組大鼠逃避潛伏期短于模型組和陰性對照組（P＜0.05）。4組大鼠水迷宮實驗穿越原平臺次數比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）；模型組、陰性對照組及CREB1過表達組大鼠穿越原平臺次數低于對照組（P＜0.05），CREB1過表達組大鼠穿越原平臺次數高于模型組和陰性對照組（P＜0.05）。見表2。

表2 4組大鼠水迷宮實驗結果比較（n=10，±s）

表2 4組大鼠水迷宮實驗結果比較（n=10，±s）

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2.3 4組大鼠海馬組織CREB1蛋白水平比較

對照組、模型組、陰性對照組及CREB1過表達組CREB1蛋白相對表達量分別為（0.78±0.11）、（0.11±0.03）、（0.15±0.04）和（0.42±0.08），經 方差分析，差異有統計學意義（F=181.905，P=0.000）；模型組、陰性對照組及CREB1過表達組大鼠海馬組織CREB1蛋白水平低于對照組（P＜0.05），CREB1過表達組大鼠海馬組織CREB1蛋白水平高于模型組和陰性對照組（P＜0.05）。見圖1。

2.4 4組大鼠海馬組織凋亡相關蛋白Caspase-3、Bcl-2及Bax蛋白水平比較

圖1 4組大鼠海馬組織CREB1蛋白的表達

4組大鼠海馬組織Caspase-3蛋白水平比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）；模型組、陰性對照組及CREB1過表達組大鼠海馬組織Caspase-3蛋白水平高于對照組（P＜0.05），CREB1過表達組大鼠海馬組織Caspase-3蛋白水平低于模型組和陰性對照組（P＜0.05）。4組大鼠海馬組織Bcl-2蛋白水平比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）；模型組、陰性對照組及CREB1過表達組大鼠海馬組織Bcl-2蛋白水平低于對照組（P＜0.05），CREB1過表達組大鼠海馬組織Bcl-2蛋白水平高于模型組和陰性對照組（P＜0.05）。4組大鼠海馬組織Bax蛋白水平比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）；模型組、陰性對照組及CREB1過表達組大鼠海馬組織Bcl-2蛋白水平高于對照組（P＜0.05），CREB1過表達組大鼠海馬組織Bcl-2蛋白水平低于模型組和陰性對照組（P＜0.05）。見表3和圖2。

表3 4組大鼠海馬組織Caspase-3、Bcl-2及Bax蛋白水平比較（n=10，±s）

表3 4組大鼠海馬組織Caspase-3、Bcl-2及Bax蛋白水平比較（n=10，±s）

組別 Caspase-3蛋白 Bcl-2蛋白 Bax蛋白對照組 0.15±0.05 0.94±0.12 0.12±0.04模型組 0.83±0.09 0.31±0.08 0.51±0.07陰性對照組 0.85±0.11 0.33±0.09 0.54±0.06 CREB1過表達組 0.27±0.08 0.77±0.10 0.24±0.07 F值 185.246 103.128 112.600 P值 0.000 0.000 0.000

圖2 4組大鼠海馬組織Caspase-3、Bcl-2 及Bax蛋白的表達

2.5 4組大鼠海馬組織PI3K/PKB通路蛋白水平比較

4組大鼠海馬組織PI3K蛋白水平比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）；模型組、陰性對照組及CREB1過表達組大鼠海馬組織PI3K蛋白水平低于對照組（P＜0.05），CREB1過表達組大鼠海馬組織PI3K蛋白水平高于模型組和陰性對照組（P＜0.05）。4組大鼠海馬組織p-PKB蛋白水平比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）；模型組、陰性對照組及CREB1過表達組大鼠海馬組織p-PKB蛋白水平低于對照組（P＜0.05），CREB1過表達組大鼠海馬組織p-PKB蛋白水平高于模型組和陰性對照組（P＜0.05）。4組大鼠海馬組織PKB蛋白水平比較，經方差分析，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表4和 圖3。

表4 4組大鼠海馬組織PI3K、p-PKB及PKB蛋白相對表達量比較（n=10，±s）

表4 4組大鼠海馬組織PI3K、p-PKB及PKB蛋白相對表達量比較（n=10，±s）

組別 PI3K蛋白 p-PKB蛋白 PKB蛋白對照組 0.67±0.09 0.57±0.08 0.63±0.10模型組 0.13±0.04 0.15±0.05 0.59±0.11陰性對照組 0.16±0.05 0.18±0.06 0.64±0.09 CREB1過表達組 0.38±0.07 0.42±0.08 0.67±0.11 F值 145.731 85.079 1.032 P值 0.000 0.000 0.390

圖3 4組大鼠海馬組織PI3K、p-PKB 及PKB蛋白的表達

3 討論

血管性癡呆是繼阿爾茨海默病之后與年齡相關的中樞神經功能障礙性疾病。其主要由缺血性腦血管疾病所致的腦組織局部腦血流量減少、缺氧及局部缺氧等所造成的腦血管疾病，主要表現為認知功能障礙。通過抑制血管性因素、改善腦血管損傷等均可減輕血管性癡呆的認知功能障礙癥狀[6]。血管性癡呆的發病機制比較復雜，細胞凋亡在血管性癡呆的發病中具有重要作用。細胞凋亡是生物界一種基本的生物學顯效，與細胞壞死不同，細胞凋亡指在病理因素或者外界生理因素的作用下，啟動程序基因，細胞按照一定的程序控制出現自我死亡[7]。細胞凋亡是缺血、缺氧所致神經元損傷的一種形式，與多種腦血管疾病的發生關系密切。在血管性癡呆的研究中，細胞凋亡也越來越受到重視，大腦海馬CA1區對缺血、缺氧很敏感，是海馬組織中與學習記憶關系最密切的功能區，海馬神經元的存活數量直接影響海馬神經元對信息的貯存和處理[8]。研究發現，血管性癡呆大鼠海馬區神經元大量凋亡丟失，海馬神經元的凋亡丟失是血管性癡呆發病的病理基礎之一[9]。

本文通過復制血管性癡呆大鼠模型，研究發現海馬是與認知功能關系密切的解剖學部位，水迷宮實驗和曠場實驗是檢測認知功能的常用方法。Caspase-3、Bcl-2及Bax是目前最受關注的凋亡調控基因，Caspase-3是細胞凋亡過程中最重要的凋亡執行蛋白酶，其激活依賴Cyc-c的釋放[10]；Bcl-2、Bax是細胞凋亡的重要調控基因，可通過線粒體途徑導致Cyc-c物質的釋放，從而激活Caspase-3，執行細胞凋亡。Bcl-2、Bax不僅可作為Caspase-3的上游調控基因，而且參與調節Caspase-3活性；可作為Caspase-3底物對Caspase-3下游發揮作用，Bcl-2/Bax可反映細胞的凋亡傾向，Caspase-3、Bcl-2及Bax在細胞凋亡中相互影響、相互制約[11]。PI3K蛋白參與調節細胞增殖、分化及凋亡等多種功能，PI3K由1個催化壓積和1個調節亞基組成，為異源二聚體[12]；PKB為其下游重要信號通路，PI3K被激活后可以產生第二信使磷脂酰肌-醇-3，4，5-三磷酸；其磷酸化PKB蛋白的Ser308，導致PKB磷酸化，磷酸化的PKB通過下游因子調節細胞的增殖、凋亡等過程[13]。本研究結果表明，血管性癡呆模型大鼠存在認知功能障礙，其發生機制可能與血管性癡呆大鼠腦組織缺血、缺氧，造成海馬組織通過PI3K/p-PKB通路促進海馬神經元細胞凋亡，從而引起海馬神經元損傷，導致認知功能障礙。

本文對血管性癡呆大鼠海馬組CREB1水平進行研究發現，CREB與記憶關系密切，在大腦神經細胞活動時，CREB可幫助激活一些與長期記憶形成關系密切的基因，從而有利于長期記憶的形成。研究發現，記憶力強的大鼠CREB處于活躍狀態[14-15]。CREB1位于2q32～q34染色體上，為CREB編碼基因，具有促進血管形成，抑制神經元細胞凋亡等多種功能[16-17]。CREB1在腦缺血性疾病中具有腦保護作用[18]。抑郁癥大鼠海馬等腦區CREB1水平下降，其可能參與調控抑郁癥的發病過程[19-20]。本研究結果表明，CREB1可能參與CREB1的發病過程，過表達CREB1可能通過激活PI3K/PKB信號通路，抑制海馬神經元細胞凋亡，從而發揮神經保護作用，改善大鼠的認知功能障礙狀態。

綜上所述，CREB1可能通過PI3K/PKB通路抑制神經元細胞凋亡，改善血管性癡呆的認知功能障礙，CREB1有望成為血管性癡呆預防和治療的潛在靶點。