特發性心房顫動患者Th17細胞及其細胞因子的表達水平及相關性研究

謝文超，劉明，鄒光新，林智海，姚光

（1.玉林市第一人民醫院 心內科，廣西 玉林 537000；2.玉林市第四人民醫院 心內科，廣西 玉林 537012）

心房顫動（atrial fibrillation,AF）是臨床常見的心律失常，往往與腦卒中、心力衰竭密切相關。現有的成果表明AF與炎癥有密切關系[1-2]。AF患者心房組織有炎癥浸潤，炎癥反應導致心房、心室纖維化，形成炎癥-纖維化惡性循環，促進AF的進展[3]。有研究證實，AF炎癥浸潤表現為淋巴細胞等免疫細胞在心房組織募集并釋放相關細胞因子[4]。

輔助性T淋巴細胞亞群17（helper T cell 17,Th17）是CD4+T淋巴細胞的一個亞群，主要分泌白細胞介素-17（Interleukin 17,IL-17）。Th17和IL-17廣泛參與心血管疾病的發生、發展。然而，Th17與特發性AF的關系如何，目前研究不多，故筆者設計本研究，以期為治療AF提供新的靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年2月—2018年2月于玉林市第一人民醫院心內科就診的特發性AF患者80例。根據2010年歐洲心臟病學會指南對AF患者進行診斷分型及分組[5]。其中，陣發性心房顫動（paroxysmal atrial fibrillation,PAF）患者34例作為PAF組，慢性心房顫動患者46例作為慢性房顫組。選取年齡匹配的同期健康體檢者80例作為對照組。納入標準：根據心電圖或者動態心電圖提示為AF。排除標準：①器質性心臟病合并AF，包括冠狀動脈硬化性心臟病合并AF、先天性心臟病合并AF、瓣膜性心臟病合并AF、肺源性心臟病合并AF及心肌病合并AF；②急性或者慢性炎癥；③自身免疫性疾病如心肌炎、風濕熱及類風濕性疾病等；④甲狀腺功能異常；⑤嚴重肝、腎功能不全；⑥惡性腫瘤；⑦近期開放性手術及創傷史。本研究經本院倫理委員會批準通過，患者均遵循自愿原則。

1.2 診斷標準

PAF診斷：AF患者在發病7 d內自行終止或進行干預后終止；慢性心房顫動診斷：包括持續性或永久性AF，指患者AF持續時間＞7 d，或患者和臨床醫生共同決定放棄恢復和/或維持竇性心律的治療。

1.3 主要試劑及儀器

CD4-FITC抗體、IL-17-PE抗體及IgG1-PE同型對照抗體購自美國BD公司。IL-17酶聯免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）試劑盒、IL-6 ELISA試劑盒、IL-22 ELISA試劑盒及基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase 9,MMP-9）ELISA試劑盒購自美國RayBiotech公司，FC-500型流式細胞儀購自美國貝克曼公司。

1.4 方法

1.4.1 標本處理所有患者在清晨抽取靜脈血，分別置于普通干燥管5 ml、抗凝管2 ml。2 h內將5 ml外周血在4℃、以2 000 r/min離心20 min取上層血清，-80℃保存。2 ml抗凝血按照Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）。用RPMl 1640培養液+胎牛血清重懸PBMCs，加入刺激劑50μg/L佛波酯、500μg/L離子霉素及1.7μg/ml莫能霉素在37℃、5%二氧化碳CO2細胞培養箱培養4 h，PBS清洗后離心備用。加入CD4-FITC抗體，4℃避光孵育30 min，固定和破膜后均分為2管，對照管加入IgG1-PE 10μl，測定管加入IL-17-PE 10μl，避光孵育30 min，用流式細胞儀檢測。

1.4.2 Th17細胞檢測Th17細胞數量以IL-17+細胞數量表示，Th17細胞百分率以IL-17+細胞數量除以CD4+T細胞數量表示，用前向散射光及側向散射光圈出淋巴細胞，以CD4+T細胞設門，檢測IL-17-PE+細胞數量。流式結果分析使用FlowJo軟件（美國 Tree Star公司）。

1.4.3 ELISA檢 測血 清IL-17、IL-6、IL-22及MMP-9表達水平按照ELISA試劑盒說明書進行檢測。

1.4.4 超聲心動圖檢測心臟彩超測量左心房內徑（left atrial dimension,LAD）、右房內徑（right atrial dimension,RAD）、左心室舒張末期內徑（left ventricular end diastolic dimension,LVDd）及左心室射血分數（left ventricular ejection fraction,LVEF）。

1.5 統計學方法

數據分析采用SPSS 19.0統計學軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用單因素方差分析，進一步兩兩比較用SNK-q檢驗；計數資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗，相關性分析用Spearman相關分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組患者一般資料比較

3組患者在年齡、男性比例、高血壓、糖尿病及吸煙方面比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 3組患者Th17細胞及其細胞因子比較

2.2.1 Th17細胞百分率對照組、PAF組、慢性房顫組患者Th17細胞百分率分別為（0.95±0.22）%、（2.98±0.38）%和（3.17±0.52）%，經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=695.000，P=0.000）；進一步兩兩比較經SNK-q檢驗，PAF組、慢性房顫組高于對照組（P＜0.05），慢性房顫組高于PAF組（P＜0.05）。見圖1、2。

2.2.2 IL-17對照組、PAF組、慢性房顫組外周血IL-17濃度分別為（11.42±5.67）、（33.64±8.95）和（38.16±11.88）pg/ml，經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=170.400，P=0.000）；進一步兩兩比較經SNK-q檢驗，PAF組、慢性房顫組高于對照組（P＜0.05），慢性房顫組高于PAF組（P＜0.05）。見圖3。

2.2.3 IL-6對照組、PAF組、慢性房顫組外周血IL-6濃 度 分 別 為（11.66±6.85）、（21.94±9.02）和（26.05±9.89）pg/ml，經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=48.910，P=0.000）；進一步兩兩比較經SNK-q檢驗，PAF組、慢性房顫組高于對照組（P＜0.05），慢性房顫組高于PAF組（P＜0.05）。見圖3。

2.2.4 IL-22對照組、PAF組、慢性房顫組外周血IL-22濃 度 分 別 為（0.33±0.24）、（0.79±0.22）和（0.91±0.38）pg/ml，經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=71.230，P=0.000）；進一步兩兩比較經SNK-q檢驗，PAF組、慢性房顫組高于對照組（P＜0.05），慢性房顫組與PAF組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖3。

2.3 3組患者MMP-9水平比較

對照組、PAF組及慢性房顫組患者MMP-9水平 分 別 為（194.71±86.95）、（386.52±132.41）和（541.86±200.68）ng/ml，經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=95.450，P=0.000）；進一步兩兩比較經SNK-q檢驗，PAF組、慢性房顫組高于對照組（P＜0.05），慢性房顫組高于PAF組（P＜0.05）。見圖4。

表1 3組患者一般資料比較

圖1 3組患者Th17細胞表達流式圖

圖2 3組患者Th17細胞百分率比較（±s）

圖3 3組患者IL-17、IL-6及IL-22濃度比較（±s）

圖4 3組患者MMP-9水平比較（±s）

2.4 AF患者Th17細胞百分率與超聲心動圖參數的相關性

AF患者Th17細胞百分率與LAD呈正相關（rs=0.387，P=0.028），與LVEF呈負相關（rs=-0.268，P=0.035），與RAD和LVDd無相關性（rs=0.045和0.156，P=0.827和0.581）。

3 討論

本研究發現，AF患者外周血中Th17細胞及其分泌的IL-17、IL-6及IL-22較對照組升高，而Th17細胞是一類強烈促炎細胞，表明AF與Th17細胞介導的炎癥浸潤相關。Th17細胞是近年來發現的CD4+T淋巴細胞亞群，其主要通過分泌的IL-17在心血管疾病中起著重要的作用。WU等[6]研究表明Th17細胞分泌的細胞因子在AF患者中高表達，提示Th17細胞參與AF的病理進程。HE等[7]發現在冠狀動脈旁路移植術后出現AF的患者Th17/Treg比例失衡，其可以作為預測術后AF的準確性、特異性的指標。葛衛力等[1]的研究提示在持續性AF患者中，Th17及其細胞因子IL-17升高。這些研究都表明Th17細胞及IL-17與AF密切相關。而筆者的研究對象是特發性AF患者，排除器質性心臟病，減少臨床混雜因素影響，提供更加直接的證據表明AF與炎癥相關。既往研究表明，持續性或永久性AF患者的CRP水平明顯高于PAF患者，提示較高的炎癥因子可能與AF程度有關[8]。本研究也發現慢性心房顫動患者Th17細胞及IL-17、IL-6較PAF升高，提示慢性心房顫動的炎癥水平高于PAF，表明炎癥與AF進程相關。

本研究還發現，外周血IL-6在PAF及慢性心房顫動患者中高表達，與AULIN等發現血清中的CRP和IL-6在AF期間顯著增加的結果是一致的[9]。CANPOLAT等[10]報道稱血清IL-6水平升高與電復律和導管消融后AF復發風險增加有關。在長期隨訪中，血清IL-6水平與接受抗凝治療的永久或者陣發性AF患者的不良事件和死亡率有關[11]。這些證據表明，IL-6與AF有密切聯系，而IL-6是Th17細胞分泌的細胞因子之一，也就是表明，Th17細胞可以通過分泌IL-6引起心房炎癥浸潤導致AF。但是IL-6來源不只是Th17細胞，最近的研究表明，活化的B細胞可以通過分泌IL-6促進CD4+T細胞分化為Th17細胞[12]。所以，在免疫調控網絡中，IL-6在不同的作用靶點扮演不同的角色，而IL-6如何發揮不同的生物學效應還需進一步研究。

結構重構、電重構在AF的發生發展中起著重要的作用，其中結構重塑與細胞外基質（extracellular matrix,ECM）有關。而ECM的組成和變化又由MMPs調節。IYER等[13]研究發現MMP-9在心肌梗死后ECM重塑中起關鍵作用。本研究發現，MMP-9在PAF及慢性心房顫動患者中升高，并且在慢性心房顫動患者較PAF患者增高，提示AF與心肌重構有關。進一步研究表明，持續性AF患者血清纖維蛋白炎癥生物標志物MMP-9、Ⅲ型膠原及hs-CRP水平高于無AF對照組，并且與左房容積、心房重構指數呈正相關[14]。但Th17或者IL-17如何影響MMP-9還需進一步的研究。

綜上所述，PAF及慢性心房顫動患者Th17細胞激活，其分泌的IL-17、IL-6及IL-22升高，并且纖維化標志物MMP-9也高表達，與AF的進程有關，炎癥和纖維化共同作用于AF的發生與發展。本研究樣本量偏小，且為單中心研究，今后還需要多中心、大樣本量研究進一步證實。