大豆GmDGAT3基因的鑒定及表達分析

張 飛，高慧玲，劉寶玲，薛金愛，張紅梅，李潤植

（1.山西農業大學生命科學學院，山西太谷030801；2.山西農業大學分子農業與生物能源研究所，山西太谷030801）

大豆（Glycine max L.Merr）是我國四大油料作物之一，也是世界主要糧油作物。大豆種子含有豐富的油脂和植物蛋白，大豆油除了人和動物直接消費之外，還是生物燃料和化學生產的主要可再生資源[1]。目前全球植物油產量的30%均來源于大豆油，并且還在逐年上漲[2]。因此，培育高油大豆品種和提高大豆油產量對大豆育種至關重要。

三酰甘油（triacylglycerol，TAG）是植物中主要的儲存脂質。在種子中，TAG在細胞內質網（ER）膜上合成并通過出芽方式儲存于油體內[3]。TAG的合成通常被認為由Kennedy途徑的相關酶催化，這些酶依次將酰基鏈從酰基-CoA轉移到甘油骨架的sn-1，sn-2和sn-3位置而形成TAG[4]。二酰甘油酰基轉移酶（Diacylglycerol acyltransferase，DGAT）參與TAG合成的最后一步反應，通過將酰基從酰基-CoA轉移到二酰基甘油（sn-1，2-diacylglycerol，DAG）的sn-3位置而起作用，是TAG合成的限速酶[5]。多重證據表明，DGAT在種子發育過程中影響種子含油量、脂肪酸組成以及種子百粒質量等[6-9]。目前，根據DGAT的結構、亞細胞定位等信息，可將DGAT酶分為3種類型：DGAT1，DGAT2和DGAT3[10]。其中，DGAT1和DGAT2為膜結合蛋白酶，但彼此之間不具同源性[11-12]。現已在擬南芥（Arabidopsis thaliana）、油菜（Brassica napus）和大豆等植物中分離出編碼有功能的DGAT1或DGAT2的基因，這2類DGAT對不同植物種子油合成積累貢獻大小有差異[9，13-15]。DGAT3又稱胞質 DGAT（Cyto DGAT），為可溶性酶蛋白，最初從花生（Arachis hypogaea）發育中的子葉細胞質中分離獲得，且具有DGAT酶活性[16]。DGAT3基因與DGAT1和DGAT2基因家族的相似性不足10%。目前，在擬南芥、亞麻薺（Camelina sativa）和大豆等油料作物中也發現了DGAT3的同源序列，但還未有功能驗證[1，17]。已有研究顯示，大豆基因組存在多個拷貝的DGAT3序列[1]，但各成員特性以及是否具體參與種子油脂的合成與積累還未證明。

本研究采用生物信息學工具，從大豆全基因組數據庫中篩選、鑒定大豆DGAT3蛋白，比較分析大豆DGAT3蛋白與花生DGAT3蛋白的理化性質、保守結構域、高級結構等特征，并檢測大豆DGAT3基因的時空表達譜，以期深入解析大豆種子油脂生物合成及調控機制，為大豆種子油脂改良及高油品種培育提供科學參考。

1 材料和方法

1.1 大豆種質及大豆DGAT3蛋白的鑒定

試驗所用大豆種質材料為大豆品種Jack，種植于山西農業大學農作站網室，由山西農業大學分子農業與生物能源研究所保存及管理。

以花生AhDGAT3基因為檢索序列，在Phytozome v12.1的大豆基因組（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Gmax） 中進行Blast分析，鑒定獲得2個完整的大豆DGAT3基因，分別命名為 GmDGAT3-1（Glyma.13G118300.1）和 GmDGAT3-2（Glyma.17G041600.1）。

1.2 大豆GmDGAT3蛋白的基本結構分析

利用在線預測網站（http://www.expasy.org），對大豆GmDGAT3同源蛋白家族的分子量、等電點、親水性、穩定性等方面進行預測，分析大豆GmDGAT3的基本理化性質。使用在線軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）預測大豆 GmDGAT3基因編碼蛋白的亞細胞定位，利用在線軟件TMHMMServer v.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析GmDGAT3蛋白的跨膜區，使用在線軟件（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）解析大豆GmDGAT3基因編碼蛋白的二級結構，用NCBI保守結構域數據庫網站（Conserved Domain Database，CDD）對 GmDGAT3蛋白的保守功能域分析，使用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）同源建模，分析大豆GmDGAT3基因編碼蛋白的三維結構。

1.3 大豆GmDGAT3蛋白的多序列比對和系統發育分析

表1 不同植物DGAT3蛋白的基本信息

使用在線軟件PRALINE program（http://www.ibi.vu.nl/programs/pralinewww/）對大豆 GmDGAT3 和花生AhDGAT3進行氨基酸序列多重比對分析；運用MEGA 6.0，采用鄰位連接法對大豆GmDGAT3和源于其他物種DGAT3蛋白序列（表1）構建系統進化樹。

1.4 大豆GmDGAT3的表達檢測

根據鑒定獲得2種大豆GmDGAT3 CDS序列GmDGAT3-1和GmDGAT3-2，利用Primer 5.0設計qTR-PCR引物，內參基因Actin引物和目的基因定量引物如表2所示。

表2 熒光定量PCR引物

本試驗使用BBI Life Science公司的Total RNA Extractor試劑盒提取大豆根、莖、葉、花、種子的總RNA，將所得到的RNA樣品保存于-80℃備用。使用Genstar公司反轉錄試劑盒cDNA Synthesis Kit合成cDNA模板。用Genstar公司2×增強型染料實時熒光定量PCR預混液進行qRT-PCR，反應體系包括：1 μL DNA模板，正向和反向引物（定量引物列于表 1）各1μL（10nmol/L），21μLRNase-freeH2O，25 μL 2×RealStar Green Power Mixture 混合，1 μL ROXReferenceDye（50×）。反應程序為：95℃10min；95℃ 15 s，53 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，40 個循環。每個樣品至少做3次生物學重復。

2 結果與分析

2.1 GmDGAT3蛋白的理化性質分析

為了進一步確定大豆GmDGAT3蛋白質的理化性質，對預測編碼的氨基酸組成及理化性質進行了分析（表3）。由表3可知，GmDGAT3-1和GmDGAT3-2蛋白質所含氨基酸的數目分別為327，338個氨基酸，相對分子量分別為34.73，35.88 ku，其等電點也均為堿性。預測蛋白的不穩定指數分別為40.63和38.95，為不穩定蛋白。脂肪酸指數和親水性指數分析表明，GmDGAT3為水溶性蛋白，定位于細胞質中。大豆GmDGAT3蛋白質的理化性質與花生AhDGAT3相似性高。CUI等[18]從硅藻中分離的PtDGAT3基因編碼的蛋白長504個氨基酸，相對分子量為64.5 ku，可以明顯看出，高等植物的DGAT3蛋白的大小和長度要比低等植物短的多。大豆GmDGAT3基因編碼蛋白的亞細胞定位預測結果顯示，2個GmDGAT3蛋白最有可能定位在細胞質中。跨膜區分析結果顯示，GmDGAT3編碼的蛋白均無跨膜結構，表明大豆GmDGAT3蛋白與花生AhDGAT3蛋白一樣，均為可溶性蛋白。

表3 大豆DGAT3和花生DGAT3蛋白質理化性質分析

2.2 GmDGAT3蛋白的高級結構分析

二級結構預測發現（圖1），GmDGAT3s是由α-螺旋、β-轉角、無規則卷曲和直鏈延伸組成。GmDGAT3-1中比例最高的為無規則卷曲和α-螺旋，比例均為37.00%；其次為直鏈延伸，占18.65%，β-轉角占7.34%。GmDGAT3-2中比例最高的為無規則卷曲，占38.17%；其次是α-螺旋，占33.14%；直鏈延伸占21.89%；β-轉角含量最少，占6.80%。各二級結構元件所占比例有較小差異，但均與花生AhDGAT3有很大程度上的相似性。

通過保守結構域數據庫（Conserved Domain Database，CDD）對GmDGAT3蛋白的保守功能域分析，結果顯示，GmDGAT3-1和GmDGAT3-2蛋白保守結構域都具有TRX-like Fds[19]及含有類似TRX-like Fd的結構域，屬于TRX-like Fd family超基因家族。通過SWISS對GmDGAT3蛋白進行三維結構分析（圖2），以ID1m2b.1一種鐵氧還蛋白為模板，對GmDGAT3-1，GmDGAT3-2和花生AhDGAT3進行建模分析，其與模板的相似性分別為25.00%，25.97%和19.23%，均由2個亞基組成，且均勻對稱。

2.3 GmDGAT3蛋白氨基酸序列比對及系統進化樹分析

使用PRALINE program在線軟件對比大豆GmDGAT3-1，GmDGAT3-2和花生AhDGAT3的氨基酸序列，結果顯示，GmDGAT3-1，GmDGAT3-2和花生AhDGAT3的序列相似性分別為45%和43%，GmDGAT3-1和GmDGAT3-2之間序列相似性為82%。對比其他DGAT蛋白相關保守序列可知（圖3），Ⅰ，Ⅳ和Ⅵ區域為潛在的DGAT保守序列，Ⅱ為一個假定的硫酰基酰基轉移酶中間標記保守區，Ⅲ為Tyr激酶磷酸化保守位點，Ⅴ為脂肪酸結合蛋白保守區[20]。大豆GmDGAT3-1和GmDGAT3-2所存在的多個功能位點可能預示著其在油脂代謝合成中具有DGAT酶功能。

將大豆GmDGAT3的蛋白序列與已知的DGAT3的蛋白序列構建系統進化樹（圖4），結果顯示，大豆2個GmDGAT3蛋白均與豆科植物有較大的相似性，這些豆科植物包括花生、紅車軸草、綠豆、刺毛黧豆、木豆、大豆；大豆GmDGAT3與豆科植物刺毛黧豆和木豆親緣關系最近。進化關系分析顯示，大豆GmDGAT3與花生DGAT3蛋白的相似性較高，推測大豆GmDGAT3可能也具備DGAT酶活性。

2.4 大豆DGAT3在不同組織中的表達分析

為探究大豆DGAT3在不同組織中的表達情況，通過qRT-PCR檢測大豆GmDGAT3-1和GmDGAT3-2在根、莖、葉、花、莢、種子等組織中的表達。以大豆基因Actin為內參，計算各個組織中的表達情況。從圖5可以看出，GmDGAT3-1和GmDGAT3-2基因在大豆各個組織中均有表達，但表達量有明顯差異；GmDGAT3-2在各個組織中的表達量均高于GmDGAT3-1，且GmDGAT3-2在花中表達量最高，在豆莢和種子中也有較高表達。

3 結論與討論

近年來，植物油在生物柴油、食品保健、化工制藥等方面的應用越來越廣泛，需求大于供給的市場極大地促進了油脂合成相關基因的研究。DGAT作為油脂合成的限速酶，已成為人們研究的重點，并在闡明植物油脂生物合成與代謝途徑，以及利用基因工程方法改良品質方面獲得了較大發展。

本研究以花生DGAT3為模板，從大豆基因組鑒定獲得2個大豆DGAT3蛋白，分別命名為GmDGAT3-1和GmDGAT3-2。一系列理化性質分析表明，GmDGAT3-1和GmDGAT3-2蛋白均定位于細胞質中，為可溶性蛋白。然而，大豆GmDGAT1和GmDGAT2亞家族的蛋白均為疏水性蛋白，定位于細胞內質網上[21]。大豆GmDGAT3蛋白的理化性質、二級結構和三維結構均與花生AhDGAT3有很大的相似性，且都由TRX-like Fd結構域[19]的蛋白組成。多序列比較分析發現，大豆GmDGAT3蛋白存在DGAT典型的保守區以及酰基轉移酶結合位點。進化樹分析表明，大豆DGAT3蛋白與花生DGAT3蛋白同源性較高，因此，推測大豆DGAT3蛋白可能也具備DGAT酶活性。

本研究證實，大豆DGAT3在不同組織中均有表達，GmDGAT3-2在各個組織中的表達量均高于GmDGAT3-1，且在花中表達量最高，在豆莢和種子中也有較高表達。已有研究發現，大多數高等植物的DGAT1在各器官中均有表達。AtDGAT1在發育中的種子、花瓣、花芽中表達量高，而在葉和莖中表達量低[22]。而大豆的DGAT1表達模式與擬南芥DGAT1相似[23]。DGAT3可能也存在與DGAT1相似的表達模式。基于GmDGAT3-2在花中表達量最高，推測GmDGAT3-2可能與TAG參與有性生殖相關。已有報道顯示，TAG占據了花粉塊質量的30%～40%，但其在花粉中的具體作用還不清楚，可能是為花粉管生長所需膜脂的快速合成提供脂肪酸原料[24]。花生DGAT3在開花后8～24 d的種子中特異性表達，在25 d以后表達量低，在種子發育更晚的階段以及根和葉中均沒有表達[16]。推測GmDGAT3在豆莢和種子中的表達可能與種子形成過程中脂肪酸的積累有關，后期仍需進行相關的功能互補以及其他試驗驗證。自SAHA等[16]在花生子葉中發現DGAT3有DGAT功能后，DGAT3越來越引起人們注意。CUI等[18]研究發現，硅藻PtDGAT3基因可以彌補突變型H1246釀酒酵母不能合成TAG的缺陷，并優先將C18不飽和脂肪酸轉化為TAG。RANI等[25]研究發現，產油型酵母Rhodotorula glutinis的RgDGAT基因編碼的二酰甘油酰基轉移酶也屬于DGAT3類酶，為可溶性蛋白酶，其過表達也能補償酵母突變菌株H1246中脂肪酸的缺失。陶芬芳[26]研究發現，油菜BnDGAT3轉入酵母和擬南芥后能改變脂肪酸成分組成。已有研究及本研究發現，一些物種的DGAT3可能具有較高的DGAT酶活性和可能的底物特異性，這些研究極大地豐富了植物油脂生物合成與代謝調控機理理論，也將有助于提高植物油產量以及改善品質。

隨著分子生物學和全基因組測序技術的不斷發展，大豆相關功能基因陸續被挖掘[27-28]，本研究結果可為利用分子育種和基因工程等手段改良大豆品質提供理論依據，也將為大豆育種的研究提供新思路。