小麥葉綠素酶及脫鎂葉綠素水解酶活性測定條件的優(yōu)化

王繪艷，王曙光，史雨剛，孫黛珍

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801）

葉綠素（Chlorophyll，Chl）在植物葉片光合作用過程中扮演著重要的角色[1]。目前，通過生物化學(xué)和遺傳學(xué)方法已分離出參與葉綠素降解途徑的幾種酶，包括葉綠素b還原酶[2]、葉綠素酶（Chlorophyllase，CLH）[3]、脫鎂螯合物酶[4]、脫鎂葉綠素水解酶（Pheophytin pheophorbide hydrolase，PPH）[5-7]、脫鎂葉綠酸a氧化酶[8]以及紅色葉綠素代謝產(chǎn)物還原酶[9]。其中，CLH和PPH的作用是脫去葉綠素a的植醇，是葉綠素降解途徑中的2個關(guān)鍵酶。近年來，人們把焦點(diǎn)集中在研究這2個關(guān)鍵酶的生化特征上，使植株在脅迫條件下體內(nèi)葉綠素還可以保持動態(tài)平衡，目的是使植株可以更好的應(yīng)對不良環(huán)境。

激活劑、抑制劑、反應(yīng)pH、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間等一系列因素都會使酶的催化活性發(fā)生改變。前人對CLH激活劑和抑制劑的研究發(fā)現(xiàn)，不同物種間沒有差異，CLH 的激活劑有 Trition X-100，Mg2+，2-ME，使CLH催化活性變大[10-11]；而CLH的抑制劑有Hg2+，F(xiàn)e2+，Cu2+，EDTA，一定程度的抑制 CLH 催化活性[11]。前人對PPH激活劑和抑制劑的研究報(bào)道較少，可以確定的是Trition X-100是PPH的激活劑，可增大PPH酶的催化活性[12]。此外，不同來源的CLH和PPH的最適反應(yīng)pH也無差異，分別是7.4，8.0[13]。然而，大量研究表明，CLH和PPH酶活性的最適反應(yīng)溫度和最佳反應(yīng)時(shí)間常因酶的來源不同而有所差異[14-17]。關(guān)于小麥CLH和PPH酶活性的最適反應(yīng)溫度和最佳反應(yīng)時(shí)間，目前還未有報(bào)道。

本研究探討了小麥葉綠素降解關(guān)鍵酶CLH和PPH催化活性的最適反應(yīng)溫度和最佳反應(yīng)時(shí)間，旨在為這2種酶活性的研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

以小麥品種長4738為試驗(yàn)材料，種子由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥育種組提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 小麥葉片的獲得 挑選籽粒飽滿的種子置于培養(yǎng)皿中，室溫下用自來水浸泡24 h后，移入網(wǎng)盒（下有托盤）中，采用1‰濃度的花無缺培養(yǎng)，每天更換培養(yǎng)液，置于人工氣候箱中培養(yǎng)：溫度22℃，相對濕度70%，光照強(qiáng)度150 μmol/（m2·s），16 h光照/8 h黑暗。培養(yǎng)至一葉一心期（7 d左右），對幼苗進(jìn)行黑暗處理，2 d后剪取幼苗葉片，將樣品用液氮速凍后置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 葉綠素酶（CLH）活性的測定

1.2.2.1 制備丙酮粉 取6片小麥幼苗葉片，液氮中研磨成粉末，稱取3 g樣品至50 mL離心管底部，加入-20℃預(yù)冷的冷丙酮15 mL，浸提0.5 h后，10 000×g，4℃離心10 min，倒掉上清液；重復(fù)上述步驟3次。將最后的沉淀在液氮中干燥，-80℃冰箱中保存?zhèn)溆肹18]。

1.2.2.2 制備CLH粗酶液 稱取1.2.2.1中丙酮粉0.5 g，加入CLH提取緩沖液15 mL（表1），室溫下攪拌提取 0.5 h，10 000×g，4 ℃離心 20 min，上清液即為CLH粗酶液[19]。

1.2.2.3 制備底物葉綠素a溶液 取新鮮菠菜葉片，液氮中研磨成粉末，稱取5 g樣品至50 mL離心管中，加入-20℃預(yù)冷的冷丙酮10 mL，黑暗條件下浸提 12 h，10 000×g，4 ℃離心 15 min，采用分光光度計(jì)測定上清液在645，663nm下的吸光度（OD值），計(jì)算 Chl a的濃度：C（μg/mL）＝12.7A663－2.69A645[20]，稀釋上清液至葉綠素a終質(zhì)量濃度為20 μg/mL。

1.2.2.4 測定CLH活性 向10 mL試管中加入CLH反應(yīng)緩沖液1 mL（表2）、20 μg/mL的底物葉綠素a溶液0.4 mL和粗酶液0.6 mL，混勻后黑暗條件下35℃水浴中反應(yīng)40 min后，立即加入1 mL終止液（10 mmol/L KOH），然后加入-20℃預(yù)冷的冷丙酮 4 mL、正己烷 6 mL[21-23]。10 000×g，4 ℃離心5 min，取下層丙酮相，在667 nm下測定產(chǎn)物脫植基葉綠素a的吸光度（OD值），消光系數(shù)為76.79 L/（mmol·cm）[24]。

表2 CLH反應(yīng)緩沖液配方（1 L）

1.2.3 脫鎂葉綠素酶（PPH）活性的測定

1.2.3.1 制備丙酮粉 制備丙酮粉的方法同1.2.2.1。

（三）創(chuàng)新土地經(jīng)營管理方式。嚴(yán)格執(zhí)行耕地保護(hù)政策，切實(shí)加強(qiáng)農(nóng)墾耕地保護(hù)，推進(jìn)耕地?cái)?shù)量、質(zhì)量、生態(tài)“三位一體”保護(hù)，確保面積不減少、用途不改變、質(zhì)量有提高、生態(tài)功能有增強(qiáng)；農(nóng)墾土地被依法收回后再出讓的，出讓收入實(shí)行收支兩條線管理，出讓土地收益用于農(nóng)業(yè)土地開發(fā)、農(nóng)田水利建設(shè)、公益性基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)以及依法補(bǔ)充失地職工社會保障費(fèi)用。

1.2.3.2 制備PPH粗酶液 丙酮粉0.5 g，加入PPH提取緩沖溶液15 mL（表3）。室溫下輕微攪拌提取1 h，10 000×g，4℃離心20 min，上清液即為PPH 粗酶液[17]。

表3 PPH提取緩沖液（1 L）

1.2.3.3 底物脫鎂葉綠素a溶液的制備 葉綠素a溶液中加入0.1 mol/L的HCl，反應(yīng)2 min后，加入0.1 mol/L的NaOH中和反應(yīng)。

1.2.3.4 測定PPH活性 向10 mL試管中加入PPH提取緩沖溶液1 mL，0.2%Trition X-100 1 mL，PPH粗酶液0.6 mL，底物脫鎂葉綠素a溶液0.4 mL?；靹蚝笥诤诎禇l件下25℃水浴中反應(yīng)40 min后，立即加入-20℃預(yù)冷的冷丙酮4 mL和正己烷6 mL[25]。10 000×g離心5 min，在665 nm下測定反應(yīng)產(chǎn)物脫植基葉綠素a的吸光度（OD值），消光系數(shù)為32.75 L/（mmol·cm）。

1.2.4 CLH，PPH酶活性測定最適反應(yīng)溫度優(yōu)化方法步驟同1.2.2，1.2.3，反應(yīng)溫度分別設(shè)置為20，30，40，50，60 ℃。

1.2.5 CLH，PPH酶活性測定最適反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化方法步驟同1.2.2，1.2.3，反應(yīng)時(shí)間分別設(shè)置為30，60，90，120 min，反應(yīng)溫度為各自的最適反應(yīng)溫度。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對小麥葉片CLH活性的影響

2.2 溫度對小麥葉片PPH活性的影響

從圖2可以看出，在溫度小于35℃條件下，小麥葉片PPH催化產(chǎn)物脫鎂葉綠素a的量（吸光度）隨溫度的升高而升高，但當(dāng)溫度高于35℃后，反而隨溫度的升高而減少，因此，小麥PPH脫植基反應(yīng)的最適溫度是35℃。此外，與CLH相比較，PPH對溫度比較敏感，具體表現(xiàn)為反應(yīng)溫度為20，60℃時(shí)，脫鎂葉綠素a的量分別是反應(yīng)溫度為30℃時(shí)的27.5%，14.5%。

2.3 反應(yīng)時(shí)間對小麥葉片CLH活性的影響

從圖3可以看出，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，小麥葉片CLH催化產(chǎn)物脫植基葉綠素a的量（吸光度）逐漸增加，在反應(yīng)80 min后，脫植基葉綠素a的量不再增加，說明小麥葉片CLH催化反應(yīng)的最佳時(shí)間是80 min。從圖1還可以看出，小麥葉片CLH催化反應(yīng)過程對反應(yīng)時(shí)間的要求較低，具體表現(xiàn)為：在反應(yīng)30 min時(shí)，酶活性可以達(dá)到最大酶活時(shí)的63.0%，在反應(yīng)60 min時(shí)，酶活性可以達(dá)到最大酶活時(shí)的93.0%。

2.4 反應(yīng)時(shí)間對小麥葉片PPH活性的影響

從圖4可以看出，PPH脫植基過程中，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，其催化產(chǎn)物脫鎂葉綠素a的量（吸光度）也逐漸增加，當(dāng)反應(yīng)90 min后，其產(chǎn)物的量達(dá)到最大，說明PPH酶活性測定的最佳反應(yīng)時(shí)間是90 min。此外，相對于CLH，PPH對時(shí)間的要求較高，30，60 min時(shí)酶活力分別是90 min時(shí)的55.6%，68.7%。

3 結(jié)論與討論

酶的催化活性會隨溫度的變化而變化。當(dāng)溫度低于酶的最適反應(yīng)溫度時(shí)，隨著溫度的升高，酶的催化活性增加，然而，當(dāng)溫度高于酶的最適溫度后，隨著溫度的升高，酶的催化活性反而會下降。此外，反應(yīng)時(shí)間對于酶的催化活性也是至關(guān)重要的，反應(yīng)時(shí)間不足或過長，酶的催化活性都會降低。有研究表明，CLH酶催化反應(yīng)過程中的反應(yīng)溫度和時(shí)間會因來源不同而存在差異。煙草葉片CLH在35℃條件下反應(yīng)40 min后催化活性達(dá)到最大[15]；橄欖樹葉片CLH在50℃條件下催化活性最大[19]。春季和秋季銀杏葉片中CLH的最適溫度不同，分別是30，40℃，反應(yīng)時(shí)間均是10 min[14]。本研究結(jié)果表明，小麥葉片CLH則在40℃條件下反應(yīng)80 min后催化活性達(dá)到最大，反應(yīng)溫度與秋季銀杏葉片相同，但反應(yīng)時(shí)間與其他物種相差較大。

PPH酶活性測定條件的研究報(bào)道較少，如AIAMLA-OR等[17]采用25℃，40 min的反應(yīng)條件研究UV-B照射對采后花椰菜PPH活性的影響，劉振等[16]則采用25℃，90 min的反應(yīng)條件測定采后芥藍(lán)PPH的活性。本研究結(jié)果表明，小麥葉片PPH在35℃條件下反應(yīng)90 min后具有最大的催化活性，反應(yīng)溫度與其他物種的相差較大，但反應(yīng)時(shí)間與采后芥藍(lán)的相同。

本研究結(jié)果對小麥葉片葉綠素降解的2種關(guān)鍵酶CLH及PPH活性的研究具有重要參考價(jià)值，但也存在不足，主要是以一個小麥品種為試材，相關(guān)結(jié)果是否具有普遍性及代表性，值得進(jìn)一步探討。