油用牡丹籽粕低聚茋類化合物大孔樹脂富集與抑菌活性

王 露，趙笑笑，申少斐，牛顏冰

（山西農業大學生命科學學院，山西太谷030801）

牡丹為芍藥科芍藥屬，在我國種植歷史悠久，分布范圍廣。其不僅具有觀賞、藥用及文化價值，還是一種有較好經濟效益的經濟作物[1-2]。牡丹皮清熱涼血，活血祛瘀，且牡丹皮水煎劑對痢疾桿菌、傷寒桿菌等多種致病菌及致病性皮膚真菌均有抑制作用。牡丹籽油是一種新開發的食用木本植物油，不飽和脂肪酸含量豐富，營養價值高[3]。研究表明，若發生急性肝損傷，牡丹籽油有一定的保護作用[4]，牡丹籽油中的亞麻酸及其代謝物具有促進大腦發育、預防心腦血管疾病的功效，具有非常高的藥用與保健價值[5]，另外，牡丹籽油還包含多種藥理活性物質，具有抗炎、殺菌、降血糖和血脂及加強人體免疫力等功效[6-7]。

近年來，牡丹籽油日益受到人們的重視，但目前對壓榨牡丹籽油副產品牡丹籽粕的研究較少。牡丹籽粕中含有蛋白質、牡丹皂苷、低聚茋類化合物、牡丹酚等保健物質[8]，合理利用這些有效組分可以提高牡丹籽的利用率，解決牡丹籽粕造成的環境問題。尤其是低聚茋類化合物的研究，因其具有很好生物活性，包括抗菌、抗氧化、抗癌細胞等[1]，引起眾多學者的重視。現在鮮有關于油用牡丹籽粕低聚茋類化合物提取富集工藝及抑菌活性研究。

本試驗利用大孔樹脂對牡丹籽粕低聚茋類化合物粗提物進行了純化，并對富集低聚茋類提取物進行了抑菌活性研究，為高效利用油用牡丹資源提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

供試牡丹為山西汾河牡丹實業有限公司提供的油用牡丹鳳丹種子。

菌種：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）。

大孔吸附樹脂HPD-100，AB-8，購買于北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 從牡丹籽粕中提取低聚茋類化合物 將干燥后的牡丹籽粉碎成粉過篩，利用閃式提取法脫脂[9]，制備所需粉末。參考文獻[1]，牡丹籽粕低聚茋類化合物的最佳提取工藝為：以40∶1的料液比加入體積分數為70%的乙醇，70℃下超聲提取40 min。本試驗稱取10 g牡丹籽粕粉末，加入體積分數70%的乙醇400 mL（即40∶1 mL/g的液料比）后，在70℃的水浴溫度條件下，用超聲波細胞破碎機（350 W）提取40 min。將獲得的粗提液用離心機離心8 min（3 000 r/min），然后輕取上清液，用數顯型旋轉蒸發儀在60℃的條件下減壓蒸發，除去乙醇，將減壓蒸發剩下的稠狀物用50%體積分數的乙醇溶液溶解，再用布氏漏斗抽濾，將濾液定容于250 mL的容量瓶中即可得到油用牡丹籽粕低聚茋類化合物的提取液，放入冰箱在4℃條件下避光保存[1]。

1.2.2 低聚茋類物質含量的測定 按照Folin－Ciocalteu試劑法[10]測量牡丹籽粕內低聚茋類化合物提取液的質量濃度。將沒食子酸作標準比照物制標準曲線。（1）用電子天平稱取0.5 g沒食子酸對照品粉末，用適量蒸餾水溶解，定容到100 mL。（2）先用移液管分別移取上述溶液 0，1.0，2.0，3.0，5.0，7.0 mL于6個100 mL容量瓶中，然后定容至100 mL，得到的沒食子酸標準溶液濃度分別為0，0.05，0.1，0.15，0.25，0.35 mg/mL[6，10]。（3）從配制好的標準液中，各移取1mL到6個標記好的100mL容量瓶中，加入60mL蒸餾水搖勻，再用移液管各取5 mLFolin-Ciocalteu試劑混合均勻。（4）隨后在100 mL容量瓶中，各加入15 mL質量分數20%的碳酸鈉溶液，加蒸餾水定容到100 mL。20℃下避光放置0.5 h，在波長750 nm處用雙光束紫外分光光度計測定其吸光度值。

1.2.3 大孔吸附樹脂型號選擇 參考文獻 [11]，分別取經過預處理的2種樹脂（HPD-100和AB-8）1.0 g，分開放入帶有標記的細口瓶中，再向每個細口瓶中加入50 mL牡丹籽粕低聚茋類化合物的提取液，靜置吸附。12 h內，每1 h攪拌一次，且每次持續3～5 min。然后用布氏漏斗對其進行抽濾，抽濾時可加入定量（50 mL）的蒸餾水沖去樹脂表面殘留的藥液，測定并記錄母液量和殘液量以及吸附后的樹脂質量，從而求得2種樹脂靜態比吸附量。

分別將上述吸附后的2種樹脂置于2個細口瓶中，分別加入60%的乙醇溶液50 mL，5 h內每1 h攪拌一次，每次3～5min。再測洗出液中牡丹籽粕低聚茋類化合物的濃度，從而依公式求得靜態解吸率。

1.2.4 研究HPD-100型大孔樹脂吸附工藝

1.2.4.1 正交試驗 通過查閱牡丹籽粕中低聚茋類化合物的相關結構和性質[8，12]與大孔樹脂的吸附特征[13]，本試驗進行了L9（34）正交試驗。本試驗考察了上柱液濃度、裝填樹脂徑高比、上樣的流速、最大上樣量4個因素，且每個因素分別取3個水平（表1）。試驗通過測定牡丹籽粕低聚茋類物質在流出液、上樣液和洗脫溶液中的含量，進而依公式求得出動態比吸附量。

表 1 L9（34）正交試驗因素水平

1.2.4.2 泄漏試驗 準確稱取5.0 g預處理過的HPD－100型大孔樹脂，將其裝入層析柱，以B3C1的工藝經過樹脂。再用10 mL離心管收集流出液（10 mL/瓶）后測定各個離心管溶液中低聚茋類化合物的含量，作低聚茋類化合物的穿透曲線[11]，并求出飽和比吸附量。

1.2.5 優化HPD-100型大孔樹脂洗脫工藝 水溶性雜質的洗去：移液管量取50 mL低聚茋類化合物提取液以由正交試驗得出的最佳吸附工藝水平進行吸附，然后用蒸餾水沖洗大孔樹脂，用10 mL離心管連續收集12份流出液，作出蒸餾水對水溶性雜質的洗脫曲線。

正交試驗優選洗脫工藝參數：同樣進行L9（34）正交試驗，嘗試考察乙醇的用量、乙醇的體積分數與流速這3個因素，每個因素取3個水平（表2）。測量并記錄每次流出液內低聚茋類物質的質量濃度和總固含物質量，依公式求得比洗脫量（Y1）與茋類化合物純度（Y2）。

對求得比洗脫量和低聚茋類化合物質量分數進行轉化評分，100作為比洗脫量和茋類化合物純度的最高值，其他則依據 Y'1＝Y1/Y1max×100，Y'2＝Y2/Y2max×100，求得相應評分，再依據Y＝0.7Y'1＋0.3Y'2得綜合加權評分，再分析加權綜合得分[11]。

表2 洗脫工藝的參數

1.2.6 低聚茋類化合物抑菌活性試驗 供試菌種的培養：（1）LB液體培養基的配制。分別準確稱取酵母粉2.5 g、胰蛋白胨5 g、氯化鈉5 g放入燒杯中，加適量蒸餾水混勻后，用蒸餾水定容至500 mL，加入NaOH溶液用pH計調節pH值到7.0。再將溶液分裝到錐形瓶中，每瓶分裝50 mL，用封口膜和報紙進行封口，并用立式高壓蒸汽滅菌鍋在121℃的條件下滅菌20 min即可。（2）LB固體培養基的配制。如液體培養基的操作，在調節pH值到7.0后，將溶液分裝到2個250 mL錐形瓶中，每個錐形瓶中加入3.75 g瓊脂粉[14]，用封口膜和報紙進行封口，高壓蒸汽滅菌鍋在121℃的條件下滅菌20 min。當溫度降低到七八十度時，在超凈工作臺進行倒平板操作。0.5 h后將培養基倒放備用。（3）細菌的活化。取長期保存于試管的干燥大腸桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌菌落，分別放入準備好的LB液體培養基中，封口，37℃的搖床上振搖。在超干凈工作臺上，點燃酒精燈，將接種環灼燒滅菌后蘸取菌液（切記不可立即蘸取，以免高溫使菌種死亡），分別在LB固體培養基上劃線（每次劃線前接種環都要灼燒滅菌并冷卻）[15]。劃線結束后封口，置于37℃恒溫培養箱中培養，30 min后將培養基倒置。過段時間觀察細菌生長情況，如果有菌落長出，用移液槍挑單個菌落到新的LB液體培養基中，封口后在37℃搖床振搖，待液體培養基渾濁后，置于4℃中備用。

抑菌活性的測定：借助大腸桿菌與金黃色葡萄球菌的抑菌圈試驗，可驗證油用牡丹籽粕中的茋類提取物的抑菌性能[16]。在超凈工作臺進行以下操作。（1）用打孔器打出多個無菌濾紙小圓片，將其浸泡在富集前后的牡丹籽粕低聚茋類化合物提取液和蒸餾水中，浸泡在蒸餾水中的小圓片用作空白對照。（2）把培養皿底部均分成3部分，用涂布棒分別將活化好的大腸桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌均勻的涂布在LB固體培養基上（每次涂布前都需將涂布棒灼燒滅菌并冷卻），記號筆做標記。（3）把浸泡好的小圓片按標記放置于每個區域中心，可用鑷子輕輕按壓小圓片。封口后，放入37℃的恒溫培養箱培養，0.5 h后倒置。培養基上長出菌落后，測量抑菌直徑并記錄結果。

2 結果與分析

2.1 沒食子酸標準曲線的繪制

由圖1可知，以吸光度值為Y軸，沒食子酸質量濃度（μg/mL）為X軸作圖，得出本試驗的沒食子酸標準曲線的回歸方程為：Y＝0.093 4X＋0.004 6，R2＝0.999 6。從回歸方程可以看出，標準品質量濃度在0.5～3.5 μg/mL的范圍內呈線性。

2.2 2種類型大孔樹脂的比較

表3 2種樹脂對低聚茋類化合物提取液的靜態比吸附量和解吸附率結果

HPD-100型和AB-8型大孔吸附樹脂對于低聚茋類化合物提取液的吸附與解吸附能力[17]如表3所示。由表3可知，HPD-100型樹脂吸附低聚茋類化合物的能力要比AB-8型樹脂高，且解吸率在90%以上，洗脫效果好。故本試驗富集純化時選用HPD-100型大孔吸附樹脂。

2.3 HPD-100型大孔吸附樹脂的工藝研究

2.3.1 正交試驗 由表4可知，直接比較4個因素的極差為RB＞RA＞RD＞RC，即上柱液濃度是影響試驗結果的主要因子。比較同一因素的3個水平，可得 A1＞A2＞A3，B1＞B2＞B3，C2＞C3＞C1，D2＞D1＞D3，因此，可以得出最佳工藝為A1B1C2D2，即選擇徑高比1∶3，上柱液濃度1.15 mg/mL，上樣量最大是100 mL，流速 2 BV/h。

表 4 L9（34）正交設計試驗結果

2.3.2 驗證試驗 在最佳工藝A1B1C2D2下重復3次試驗，結果列于表5。由表5可知，平均動態吸附量是49.58 mg/g，水平高且效果佳，故該工藝可被采用。

表5 驗證試驗結果 mg/g

2.3.3 泄漏試驗 由圖2可知，25管流出液被收集，其濃度變為0.49 mg/mL，近似于上柱液濃度，可看做大孔樹脂可以吸附250 mL上柱液，從而得出飽和比吸附量為28.45 mg/g。

2.4 HPD-100型大孔吸附樹脂洗脫工藝優化

2.4.1 水溶性雜質的洗去 由圖3可知，樣品中的水溶性雜質隨蒸餾水份數的增多而不斷減少，12份流出液被收集后，累計流出液內的水溶性雜質百分率已經達到87%，近似看作沖洗完全。故可得出，蒸餾水沖洗用量為120 mL。

2.4.2 正交試驗優選洗脫工藝參數 由表6可知，極差Ra＞Rb＞Rc，故其影響因素主要是乙醇體積質量分數，其次是乙醇用量與流速。方差分析得出，各水平與乙醇體積分數（a）間有極顯著差異（P＜0.01），而 b，c兩因素間沒有顯著差異（P＞0.05）（表7）。故最優洗脫條件是a3b3c3，即乙醇體積分數60%，用量8 BV，流速3 BV/h。

表6 洗脫工藝正交試驗結果

2.4.3 驗證試驗 以a3b3c3條件（最佳洗脫工藝）進行洗脫（重復試驗3次），結果如表8所示。由表8可知，比洗脫量為38.86 mg/g，依公式求得總茋類化合物質量分數為36.88%，表明a3b3c3洗脫工藝的重現性很好。

2.5 油用牡丹籽粕低聚茋類化合物提取物的抑菌活性研究

由表9和圖4可知，牡丹籽粕低聚茋類化合物提取物對細菌有一定的抑菌效果。菌種不同，富集前后的抑制效果也不相同。富集后的低聚茋類化合物提取液的抑菌效果普遍優于富集前；在這3種細菌中，對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最明顯。

表7 方差分析

表8 驗證試驗結果 mg/g

表9 富集前后的低聚茋類化合物提取液對細菌的抑制作用（抑菌圈直徑） mm

3 討論

隨著生活質量的提高，人們將日益親睞牡丹籽油，而牡丹籽油的副產品牡丹籽粕含有豐富的牡丹皂苷、牡丹多糖等營養保健物質。充分利用牡丹籽粕中的有效組分可以增加牡丹籽的利用率。本試驗對油用牡丹籽粕低聚茋類化合物提取物進行了大孔吸附樹脂富集純化，并對其抑菌活性進行了研究，而之前的文獻中，大多一些是粗提物。因此，用本試驗的方法可高效利用牡丹籽粕，并解決牡丹籽粕帶來的環境污染問題。在對牡丹籽油需求日益增長的情況下，分離純化油用牡丹籽粕低聚茋類物質，采用HPD-100型大孔吸附樹脂有很好的應用前景，同時也為油用牡丹資源的綜合開發和利用奠定了理論基礎。

4 結論

本試驗以牡丹籽粕低聚茋類化合物的粗提物為原料，采用大孔吸附樹脂富集純化牡丹籽粕中的低聚茋類化合物，結果表明，富集純化牡丹籽粕中低聚茋類物質時，HPD-100型大孔吸附樹脂的純化效果比AB-8型大孔樹脂更佳，試驗得出其最佳吸附工藝為：上樣液質量濃度為1.15 mg/mL，上樣流速為2 BV/h，上樣量為100 mL，并且通過驗證試驗證明了該工藝的可行性；洗脫工藝最優為：乙醇體積分數為60%，洗脫量為8 BV，洗脫速度為3 BV/h。驗證試驗證明，牡丹籽粕中低聚茋類化合物的質量分數在最佳工藝下可達到39.52%。關于牡丹籽粕低聚茋類物質抑制細菌活性能力的研究表明，低聚茋類化合物經富集后得到的提取液的抑菌能力比富集前普遍要強；在大腸桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌中，對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最明顯。