嗜熱芽孢桿菌丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶的基因克隆、蛋白表達純化及活性分析

王文珍，王慧慧，陳美雯，徐如飛，蔣培蓉，蒲首丞，鞏菊芳，孫梅好

（浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江金華321004）

丙酮酸激酶（EC2.7.1.40，PK）催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）對核苷二磷酸（NDP）的磷酸化產生核苷三磷酸（NTP）[1-2]和丙酮酸，二價陽離子和核苷酸形成的復合體是胞內蛋白的配體[3-5]。不同物種來源的PK，其反應速率達到最大反應速率1/2時的底物濃度Km（ADP）具有較大差異。如大腸桿菌PKII和蓖麻 PK的 Km（ADP）約為 50 mol/L[6-7]，而人和褐家鼠PK的Km（ADP）均大于 1 mmol/L[8-9]。PK的最適pH大多為中性，而部分植物和剛地弓形蟲的最適pH 在 8.0 左右[6，10-11]。乳酸脫氫酶（EC1.1.1.27，LDH）催化NADH還原丙酮酸生成乳酸和NAD+及其逆反應[12]。Km（NADH），Km（pyruvate），Km（NAD），Km（lactate）在不同的物種中具有很大差別，目前報道最大的Km（lactate）是美洲螯龍蝦LDH的1100mmol/L[13]，而來自惡性瘧原蟲的 Km（lactate）僅為 47 mol/L[14]。LDH的最適pH大多為中性，來自牛[15]和鉤蟲貪銅菌[16]的LDH具有目前報道的最高且最適pH值（9.8）。PK和LDH是生物體內糖酵解過程中重要的氧化還原酶[17]，廣泛存在于動植物組織和各種微生物細胞內。通過測定NADH光吸收的變化，可以間接反映丙酮酸濃度的變化，從而可計算出PK以及LDH的酶活[12]。大多數嗜熱酶在高溫條件下仍然保持很高的催化活性，所以，嗜熱酶是目前研究和開發最多的酶之一。嗜熱菌是當前獲得嗜熱酶最直接和可靠的來源。在浙江師范大學化學與生命科學學院蛋白質結構與功能實驗室的前期工作中，發現蒼白空氣芽孢桿菌（Aeribacillus pallidus JH-7）為中度嗜熱菌（最適生長溫度為50℃），可分泌抑菌活性物質。

本研究克隆并表達嗜熱芽孢桿菌丙酮酸激酶（ApPK）和乳酸脫氫酶（ApLDH），并測定其動力學常數，分析其作為工具酶的可行性。

1 材料和方法

1.1 菌株與載體

嗜熱蒼白空氣芽孢桿菌（Aeribacillus pallidus JH-7），菌株 E.coli DH5α 及 BL21（DE3），原核表達載體pET24a，克隆載體pMD19-Tsimple等，均保存于浙江師范大學化學與生命科學學院蛋白質結構與功能實驗室-80℃冰箱。

1.2 酶與生化試劑

還原型輔酶 I（NADH）、氧化型輔酶 I（NAD+）、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、三磷酸腺苷（ATP）、鳥苷二磷酸（GDP）、脲苷二磷酸（UDP）、胞苷二磷酸（CDP）、腺苷二磷酸（ADP）、磷酸烯醇式丙酮酸、鎳柱親和層析樹脂、溶菌酶、二硫蘇糖醇、丙酮酸、L-乳酸鈉和抑肽素均購自于合肥海伯萊生物技術有限公司；兔肌肉丙酮酸激酶（OcPK）、兔肌肉乳酸脫氫酶（O-cLDH）購自于羅氏公司；DNA聚合酶，dNTP Mixture，BamH I，Sal I，EcoR I，Not I，Xho I等限制性內切酶購自于杭州皓豐生物技術有限公司；細菌基因組提取試劑盒（CW0552S）購自北京康為世紀生物科技有限公司；其他常規生化試劑為國產分析純。

1.3 方法

1.3.1 嗜熱菌pk和ldh基因克隆 參照細菌基因組提取試劑盒的使用說明，提取ApJH-7基因組，并保存于-20℃以及參考貢莎莎等[18]的原核表達載體構建。以所提基因組為模板，利用PCR擴增Appk（pkF：ACGCGTCGACCCATGCGAAAAACGAA；pkR：ATAAGAATGCGGCCGCCTCGAGTAGAACG）和 Apldh（ldhF：CCACGCGGATCCGAATTCATGAAT AAAGA；ldhR：ACGCGTCGACAATGACAGATTTCA TCGTAT）。將純化的 PCR產物連接至pMD19-T simple載體，通過熱激法轉入 E.coli，DH5α。提取經測序驗證含Appk和Apldh的質粒載體，雙酶切相應 Appk（Sal I和 Not I）和 Apldh（BamH I和 Sal I）載體，經瓊脂糖凝膠電泳回收、純化后分別連接到表達載體pET24a構建重組表達載體PK-pET24a，LDH-pET24a。分別轉化 E.coli BL21（DE3）感受態細胞，獲得ApPK和ApLDH的表達菌株。

1.3.2 ApPK和ApLDH的表達、純化 參照李鴻艷等[7]和賀飛燕等[19]的方法，將表達菌株在LB培養基中培養至OD600＝0.6，加0.5 mmol/L IPTG誘導表達（37℃，220 r/min，3 h）；離心收集菌體進行裂解、破碎、高速離心后收集上清液。經鎳柱咪唑梯度親和層析，再經SDS-PAGE鑒定含有目的蛋白的組分，合并含高純度目的蛋白組分，進行透析（50 mmol/L Hepes，pH 值 8.0）。所得目的蛋白經 Bradford 法[20]測定蛋白濃度后，于-80℃保存備用。

1.3.3 ApLDH活性測定 利用分光光度法（瓦里安UV4000，安捷倫）測定LDH酶活[12]。活性測定原理為LDH催化NADH的氧化或者NADH的生成，根據NADH在339 nm光吸收的變化可計算出LDH的活性。為分析ApLDH的最適pH，測定條件為：0.1 mmol/L NADH，0.065 μmol/L ApLDH，50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 值分別為 5.2，5.4，5.6，5.8，6.2，6.4，6.6），用 0.9 mmol/L丙酮酸起始反應，反應溫度為35℃。為分析ApLDH的溫度穩定性，ApLDH經不同溫度（30，40，50，52，54，55，56，58，60 ℃）處理45 min后，冷卻至室溫，進行活性測定。條件為：0.1 mmol/L NADH，0.065 μmol/L ApLDH，50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH＝6.0），反應溫度為35℃。為分析其最適反應溫度，利用0.1mmol/LNADH，0.065 μmol/L ApLDH和50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH＝6.0），不同的反應溫度（30，32，34，36，38，40 ℃），進行ApLDH酶活測定。為測定ApLDH的動力學常數，固定一個底物濃度為10倍Km，改變另一個底物濃度，在50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH＝6.0）和35℃條件下測定其反應活性，所得數據利用米氏方程v＝Vmax×[s]/（Km＋[s]）（其中，Vmax表示最大反應速率；[s]表示底物濃度）進行擬合，得Vmax及Km。

1.3.4 ApPK活性測定 利用分光光度法和OcLDH為偶聯酶測定ApPK酶活[12]。PK活性測定原理為PK催化NDP的磷酸化生成NTP和丙酮酸，產物之一丙酮酸可被LDH還原為乳酸，同時NADH被氧化為NAD+。根據在339 nm光吸收變化可計算出PK活性產物之一丙酮酸的生成速度。為分析其最適pH值，活性測定條件為：50 mmol/LMgCl2，0.25 mmol/L NADH，6.5 mmol/LADP，0.047 3 μmol/L PK，20 U/mL OcLDH，50 mmol/L磷酸緩沖液（pH值分別為5，6，7，8，9），利用 1.5 mmol/LPEP 起始反應，反應溫度為40℃。為分析其溫度穩定性，ApPK經不同溫度（30，40，50，55，60，65，70 ℃）處理 45 min，冷卻至室溫，進行活性測定。測定條件為：50 mmol/L MgCl2，0.25 mmol/L NADH，6.5 mmol/L ADP，0.047 3 μmol/L PK，20 U/mLOcLDH，50 mmol/L磷酸緩沖液（pH＝8.0），利用1.5 mmol/L PEP起始反應，反應溫度為40℃。為分析其最適反應溫度，利用50mmol/LMgCl2，0.25 mmol/L NADH，6.5 mmol/L ADP，0.047 3 μmol/L PK，20 U/mL OcLDH，1.5 mmol/L PEP，50 mmol/L 磷酸緩沖液（pH＝8.0），不同的反應溫度（40，45，50，55，60℃），進行ApPK酶活測定。為測定ApPK對NDP的磷酸化，利用最適的pH，溫度為45℃，其他條件為測定最適pH時的條件，改變NDP濃度測定其酶活，所得數據利用米氏方程擬合，得Vmax及Km。

2 結果與分析

2.1 嗜熱菌pk和ldh基因克隆及蛋白表達純化

PCR法擴增Appk和Apldh，其產物經電泳檢測，可見擴增產物大小與預期結果相符（圖1，2）。經酶切驗證及測序驗證表明載體構建成功。經表達菌株BL21（DE3）的誘導表達、鎳柱梯度親和層析，純化分別獲得分子量為65 ku的ApPK（圖3）和35 ku的 ApLDH（圖 4）。

2.2ApPK和ApLDH的最適pH分析

pH對酶的活性有較大影響。利用不同pH緩沖液分析ApPK和ApLDH活性，結果表明，ApPK的最適pH值為8.0，高于8.0會導致活性急劇下降，且pH值低于6.0時酶活性降至最大活性的1%左右；ApLDH的最適pH值為5.8，且酸性條件更加容易導致其活性下降（圖5）。

2.3 ApPK和ApLDH的最適反應溫度分析

溫度對酶的活性也有較大影響。利用不同反應溫度分析ApPK和ApLDH活性，結果表明，其活性受溫度影響呈典型的鐘型曲線（圖6）。ApPK和ApLDH的最適溫度分別為 50，35℃，ApPK在ApLDH的最適溫度處的活性為最大活性的60%～70%，而ApLDH在ApPK最適溫度處的活性為最大活性的62%，相對來說，其活性還是很高的。

2.4 不同陽離子對ApPK和ApLDH活性的影響

利用 2mmol/L的 Mn2+或 Mg2+，20mmol/L的 Li+，200mmol/L的K+或Na+的陽離子（一價陽離子的測定體系中Mg2+濃度為34mmol/L），分析了其對ApPK和ApLDH活性的影響。結果表明，Mn2+，Mg2+對ApLDH的活性影響較小，而極大的促進了ApPK的活性，且Mg2+促進作用強于Mn2+（除特別說明，本研究中ApPK活性測定體系均含有Mg2+）。Na+，K+和Li+對ApPK的活性具有抑制作用，Li+抑制效應最大，K+抑制效應最小。Na+抑制ApLDH的62%活性，Li+，K+抑制其 50%左右的活性（表 1）。

表1 陽離子對ApPK和ApLDH活性的影響

2.5 ApPK和ApLDH的動力學常數分析

LDH在胞內催化丙酮酸還原為乳酸。改變底物濃度測定其活性，經米氏方程擬合，發現ApLDH的Km（lactate）高達26.2 mmol/L，而其最適底物為NADH（Km（NADH）為 34.3 μmol/L），最大反應速度kcat為12.7 s-1（表2）。

表2 ApLDH的動力學常數

表3 ApPK對NDP磷酸化的動力學常數

PK在胞內催化NDP磷酸化生成相應的NTP。改變NDP濃度，測定ApPK動力學常數，結果發現，其最適底物為GDP，其Km為1.6 mmol/L。催化效率最高的為底物ADP（Kcat/Km為5×104mol/（L·s）），最低為CDP（4.0×103mol/（L·s））（表3），不同NDP的催化效率Kcat/Km比較結果為ADP＞GDP＞UDP＞CDP，且均低于大腸桿菌和兔肌肉PK（表3）。

2.6 ApPK和ApLDH的熱穩定性分析

ApLDH經30～50℃處理其活性穩定，在50～52℃時酶活急劇下降，60℃時基本已失活。ApPK經30～50℃處理其活性穩定，基本不受溫度影響，超過58℃后，其活性急劇下降（圖7）。

3 結論與討論

偶聯酶法作為測定酶活的方法被廣泛運用。而丙酮酸激酶與乳酸脫氫酶通常作為偶聯酶，在20～37 ℃測定 NDP 的產生[2，3，7，12]。本研究從嗜熱菌中克隆表達ApPK和ApLDH，可以在高溫下應用于NDP的生成酶的活性分析，以期分離鑒定能夠承受更高溫度的嗜熱酶，并分析酶的活性。

本研究成功表達、純化了ApPK和ApLDH，并分析了不同pH、溫度、陽離子對其活性的影響。結果表明，ApPK最適pH值為8.0，與植物和剛地弓形蟲PK最適pH類似；ApLDH最適pH值為5.8，與嗜熱脂肪土芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌LDH最適pH類似[22-23]。2 mmol/L二價陽離子對ApLDH活性有輕微的抑制作用，而二價陽離子是ApPK活性必需的，此結果也說明核苷酸與二價陽離子形成的復合物是激酶的底物。高于60℃的溫度對ApPK和ApLDH具有強烈滅活作用。

本研究表明，ApPK和ApLDH活性的最適溫度分別為50，35℃，有意思的是，Aeribacillus pallidus JH-7的最適生長溫度為50℃，此溫度雖然不是ApLDH的最適溫度，但是活性還是自身最大活性的62%，kcat為16.4 s-1，因此，確定在此溫度下可以作為偶聯酶。