基于低場核磁共振技術(shù)的咸鴨蛋腌制過程水分及質(zhì)構(gòu)特性變化

龍 門 張文豪 鄭素玲 齊安琪 詹 歌

(1. 滁州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽 滁州 239000；2. 滁州市食品加工研究院，安徽 滁州 239000)

咸鴨蛋是中國傳統(tǒng)蛋制品，其蛋黃沙糯的質(zhì)地和咸香的風(fēng)味深受消費(fèi)者喜愛，除直接食用外，也被廣泛用于中國傳統(tǒng)食品——月餅、粽子等中[1]。質(zhì)構(gòu)特性和鹽含量是咸鴨蛋成熟的重要品質(zhì)特性，目前研究主要集中在腌制工藝對其凝膠強(qiáng)度、持水性和鹽含量等指標(biāo)的影響[2]；同時(shí)不同的腌制環(huán)境(溫度、濕度)對咸鴨蛋成熟期有顯著的影響，而凝膠強(qiáng)度、持水性和鹽含量等指標(biāo)的測定都需要對咸蛋進(jìn)行破壞性檢測，檢測周期長，且造成原料損耗。低場核磁共振技術(shù)( low-field nuclear magnetic resonance，LF-NMR)可通過測定水分子的弛豫特性T2、與食品組分的結(jié)合狀態(tài)判斷食品中自由水、結(jié)合水、不易流動水的遷移[3-4]，同時(shí)可獲得氫離子密度圖像，分析食品中不同水分的分布狀況[5-6]。目前，LF-NMR技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于肉制品、果蔬、面制品等食品領(lǐng)域。秦影等[7]在對大黃魚魚糜的研究中發(fā)現(xiàn)，水分狀態(tài)及含量與質(zhì)構(gòu)指標(biāo)和保水率之間存在相關(guān)性，鹽離子對魚糜凝膠的強(qiáng)度、顯微結(jié)構(gòu)和水分分布都有影響[8]；徐雷等[9]研究表明雞蛋的氣室高度、蛋黃指數(shù)等與弛豫參數(shù)之間存在相關(guān)性，可利用弛豫參數(shù)預(yù)測雞蛋的貨架期，也有學(xué)者[10]發(fā)現(xiàn)白煮蛋表觀品質(zhì)的變化與蛋清和蛋黃中水分分布的變化相關(guān)。咸蛋在腌制過程中蛋清和蛋黃的質(zhì)構(gòu)特性可能受到鹽離子的影響，同時(shí)又與其水分狀態(tài)及含量變化相關(guān)。

目前關(guān)于結(jié)合LF-NMR技術(shù)研究腌制食品在加工過程中水分分布及品質(zhì)變化規(guī)律的報(bào)道甚少。基于此，本研究擬利用該技術(shù)深入分析咸鴨蛋在腌制過程中水分分布變化規(guī)律及品質(zhì)的變化，以期應(yīng)用低場核磁技術(shù)預(yù)測咸鴨蛋成熟度和品質(zhì)，以拓展此技術(shù)在腌制類食品品質(zhì)評價(jià)中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯化鈉、硝酸銀：分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；

硝酸、乙醇、硫酸鐵銨、硫氰酸鉀、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

冰乙酸：分析純，天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試廠；

食鹽：食品級，市售；

新鮮鴨蛋：滁州市白云超市。

1.2 儀器與設(shè)備

物性測試儀：TA-XTplus型，英國Stasle Micro System公司；

恒溫加熱磁力攪拌器：Cy-2型，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；

快速水分測定儀：M2-08型，杭州科博儀器有限公司；

電子天平：JA5003J型，上海越平科學(xué)儀器有限公司；

電子分析天平：FA2204B型，上海越平科學(xué)儀器有限公司；

低場核磁：MeSONMRI3-060V-I型，蘇州(上海)紐邁電子科技有限公司；

料理機(jī)：C010-7067型，九陽股份有限公司；

多功能電磁爐：C21-ST2125型，廣東美的生活電器制造有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 咸鴨蛋腌制工藝 按質(zhì)量比為5∶4將洗凈晾干的鴨蛋放入20%的食鹽腌制液中，最上層壓以適量重物以保證所有鴨蛋都浸沒在腌制液中，在(20±5) ℃下進(jìn)行腌制，每隔3 d翻動原料蛋1次。每隔5 d隨機(jī)選取一定數(shù)量的咸鴨蛋，將咸鴨蛋用溫開水洗凈后，放于沸水的蒸籠上蒸20 min，測定各項(xiàng)理化指標(biāo)。

1.3.2 水分測定 按GB 5009.3—2016的直接干燥法執(zhí)行。

1.3.3 NaCl測定 按GB 5009.44—2016的間接沉淀滴定法執(zhí)行。

1.3.4 低場核磁共振分析方法 根據(jù)Aursand等[11]的方法略作修改：分別取一定質(zhì)量(m)的蛋清凝膠或蛋黃凝膠放入直徑60 mm的玻璃試管中，將樣品管置于NMR探頭中(保持溫度32 ℃)，使用CPMG序列測試橫向弛豫時(shí)間T2，測試條件：接收機(jī)帶寬100 kHz，采樣起始點(diǎn)控制參數(shù)0.200 ms，重復(fù)采樣時(shí)間間隔2 500.000 ms，模擬增益 10.0 db，90°和 180°脈寬分別為16， 31 μs，采樣點(diǎn)數(shù)469 804，數(shù)字增益2，數(shù)據(jù)半徑1，累加掃描次數(shù)8，回波個(gè)數(shù)18 000。試驗(yàn)取4份平行，每份平行測3次。然后對其進(jìn)行反演，得到T2譜圖，對峰面積進(jìn)行累計(jì)積分，得到峰面積A。

1.3.5 低場核磁成像分析方法 根據(jù)劉斯琪[12]的方法略微修改：將咸鴨蛋洗凈后置于NMR探頭中(保持溫度32 ℃)，采用多層自旋回波序列(Multi-Slice Echo，MSE)進(jìn)行質(zhì)子加權(quán)成像，Y軸為選層梯度，X軸為相位梯度，Z軸為讀出梯度，90°和 180°軟脈沖均為20.000 ms，重復(fù)采樣時(shí)間為500.000 ms，半回波時(shí)間為20.000 ms，選層梯度脈沖(90°)對應(yīng)的補(bǔ)償梯度為1.4%，選層梯度脈沖(180°)對應(yīng)的補(bǔ)償梯度脈沖為6.6%。

1.3.6 質(zhì)構(gòu)分析方法 將冷卻到室溫的蛋清或者蛋黃切成近似20 mm×20 mm×20 mm的正方體，采用物性測試儀測定其質(zhì)構(gòu)參數(shù)。使用型號為P/36R探頭對樣品進(jìn)行連續(xù)兩次50%的擠壓。測定條件：測前速度1 mm/s；測試速度4 mm/s；測后速度4 mm/s；壓縮程度50%；停留時(shí)間5 s；數(shù)據(jù)采集速率400 pps；觸發(fā)值0.196 N。

1.3.7 持水力測定 參考Kocher等[13]的方法并略有修改，取3 g冷卻到室溫蛋清凝膠樣品加入離心管中，12 000 r/min 離心15 min，去除離心出的水分，稱量凝膠質(zhì)量。按式(1)計(jì)算持水性：

WCH=(m1-m0)÷(m2-m0)×100%，

(1)

式中：

WCH——凝膠持水力，%；

m1——離心后凝膠質(zhì)量，g；

m0——離心管質(zhì)量，g；

m2——離心前凝膠質(zhì)量，g。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理

所有數(shù)據(jù)利用Microsoft Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，采用Origin 9.0進(jìn)行作圖分析。不同平均值之間用SAS 8.2(SAS Institute Inc, Cary, North Carolina, USA)統(tǒng)計(jì)軟件的GLM程序(General Linear Model procedure)中的鄧肯氏多重比較法(Duncan' s Multiple Range Test)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 咸鴨蛋腌制過程中鹽分和水分的變化

由圖1可知，腌制過程中，蛋清與蛋黃中水分含量顯著降低(P<0.05)，而鹽分含量顯著上升(P<0.05)，在腌制后期變化逐漸趨于平緩。腌制過程中，水分和鹽離子從蛋殼上的空隙遷出和遷入，蛋黃中水分的降低程度大于蛋清，而鹽分含量的升高程度小于蛋清，可能是由于：① 蛋清和蛋黃中水分含量的差異導(dǎo)致滲透壓不同，物質(zhì)遷移的速率不同； ② 物質(zhì)遷移過程中遇到的阻力不同，對遷移速率的影響不同，蛋黃的密度相比于蛋清更高，內(nèi)部的脂肪等物質(zhì)對鹽分的阻滯力度更大[14-15]；③ 蛋清和蛋黃中不同的蛋白質(zhì)種類，與水分的結(jié)合程度不同，也會對水分的遷移有所影響[16-17]。

圖1 不同腌制時(shí)期咸鴨蛋蛋黃、蛋白水分和鹽分變化Figure 1 Moisture and salt content of albumin and yolk gel during salting period

2.2 腌制過程中蛋清和蛋黃水分分布及遷移的變化

蛋清凝膠的反演圖譜中共有3個(gè)峰，分別為T21(0.1～10.0 ms)、T22(10～100 ms)和T23(100～1 000 ms)，而蛋黃的反演圖譜有4個(gè)峰，各自是T21(0.1～2.0 ms)、T22a(8～30 ms)、T22b(40～150 ms)和T23(150～500 ms)；蛋清和蛋黃中弛豫時(shí)間為T21的為結(jié)合水，T22、T22a和T22b的為不易流動水，T23的為自由水。T2弛豫曲線的積分面積正比于氫質(zhì)子的含量，即水分含量，而不同積分面積占總積分面積的百分比可表示不同狀態(tài)水占總水分的相對比例[18-21]。

如圖2(a)所示，腌制過程中，蛋清凝膠的弛豫曲線向右偏移，在腌制后期曲線的變化趨于穩(wěn)定，表明蛋清凝膠中水分受到的束縛力減弱；圖3(a)反映了3種狀態(tài)水的相對比例變化情況，其中結(jié)合水和不易流動水的相對比例在下降，而自由水的相對比例在上升；蛋清凝膠對水分束縛力減弱的原因可能是凝膠結(jié)構(gòu)中孔徑變大[22]，同時(shí)，蛋白質(zhì)與水分的結(jié)合作用被削弱[23-24]。因?yàn)殡缰七^程中，滲入蛋清中帶電的鈉離子和氯離子，一方面會屏蔽蛋白質(zhì)上的電荷，降低蛋白質(zhì)間的斥力，蛋白質(zhì)易于相互靠近[17,25]；另一方面會影響維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的二硫鍵、氫鍵和疏水鍵等次級鍵，并使得蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水鍵暴露，在疏水相互作用和分子間二硫鍵作用下，靠近的蛋白質(zhì)會相互聚集[24]；在熱誘導(dǎo)凝膠的形成過程中，蛋白質(zhì)之間過早的靠近和聚集，更易于形成無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，造成凝膠結(jié)構(gòu)中孔徑較大，凝膠對不易流動水分的束縛力降低，滯留的水分易于轉(zhuǎn)變?yōu)樽杂伤甗17]；同時(shí)，疏水鍵的暴露也會減弱蛋白質(zhì)與水分的結(jié)合作用，而鹽離子會破壞蛋白質(zhì)的親水基團(tuán)與水分子之間的氫鍵等作用力， 結(jié)合水與凝膠結(jié)構(gòu)的結(jié)合度降低，水分的自由度增加[23]。

由圖2(b)可知，腌制過程中蛋黃的弛豫曲線向左偏移，表明蛋黃中水分受到的束縛力增強(qiáng)，由圖3(b)可得結(jié)合水的相對含量增加，而自由水的相對含量前期增加后期降低。蛋黃中水分受到束縛力增強(qiáng)的原因可能是形成了脂蛋白—水—NaCl復(fù)合物，使得水分結(jié)合更加緊密[26]。

圖2 蛋清和蛋黃凝膠的水分弛豫時(shí)間T2Figure 2 Water relaxation time(T2) of egg white and yolk

圖3 蛋清和蛋黃凝膠中3種狀態(tài)水分的相對百分含量Figure 3 Relative content of three states of water in egg white and yolk

蛋黃由漿液和顆粒組成，隨著鹽離子的滲入，蛋黃顆粒中高密度脂蛋白(HDL)與卵黃高磷蛋白結(jié)合的磷酸鈣橋中的鈣離子被鈉離子取代，破壞了蛋黃的顆粒結(jié)構(gòu)。可溶性的卵黃高磷蛋白溶出到漿液中[12,27]，漿液中水分含量較高，在鹽離子和脫水作用下黏度增加，其中的蛋白質(zhì)聚集體相互結(jié)合，破壞乳化體系，導(dǎo)致腌制前期部分不易流動水轉(zhuǎn)變?yōu)樽杂伤杂伤南鄬Ρ壤黾覽12]，同時(shí)，在熱誘導(dǎo)作用下聚集的蛋白質(zhì)與水，形成了脂蛋白—水—NaCl復(fù)合物，使得水分受到的束縛力增強(qiáng)[28]。

2.3 腌制過程咸鴨蛋核磁成像變化

圖4為咸鴨蛋低場核磁共振成像圖，亮度越高，氫質(zhì)子的密度越高，水分含量越高[4,26]。由圖4可知，未腌制時(shí)，蛋清中整體較亮，水分分布較均勻，相比于內(nèi)層濃厚蛋白，外層稀薄蛋白中水分含量更高；而蛋黃中的亮度較暗，其中外層亮度較高，表明外層漿液水分含量更高；隨著腌制時(shí)間的延長，蛋清中的亮度逐漸降低，亮區(qū)逐漸減少到只剩邊緣，表明整體水分不斷減少，而內(nèi)層水分向外層遷移；蛋黃中的外層亮度不斷降低，外層水分逐漸向蛋清遷移，而內(nèi)部脂質(zhì)中氫質(zhì)子的亮區(qū)逐漸集中而亮度不斷增加，表明在脫水和鹽離子作用下，蛋黃中的脂蛋白顆粒在內(nèi)部聚集并結(jié)合地更加緊密，在腌制后期，蛋清和蛋黃中亮度的變化逐漸趨于穩(wěn)定，水分的變化也趨于穩(wěn)定。

圖4 咸鴨蛋低場核磁共振成像圖Figure 4 Magnetic resonance image of duck egg during salting period

2.4 蛋清和蛋黃質(zhì)構(gòu)特性變化

由表1可知，在腌制過程中，蛋清凝膠的硬度、彈性、內(nèi)聚性和咀嚼性都在顯著降低(P<0.05)，后期逐漸穩(wěn)定，而凝膠持水力前期顯著降低(P<0.05)，后期略有升高；硬度、彈性、內(nèi)聚性、咀嚼性和凝膠持水力的顯著降低(P<0.05)，可能是蛋清凝膠中的孔徑增大和交聯(lián)度的降低[22-24]，而這可能與鹽離子和熱誘導(dǎo)作用有關(guān)，帶電的鹽離子會破壞蛋白質(zhì)的次級鍵，影響蛋白質(zhì)的極性基團(tuán)與水分的結(jié)合，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)β-折疊的含量增加，α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角的含量下降，同時(shí)，內(nèi)部的疏水鍵暴露[19]，使相鄰蛋白質(zhì)更易聚集，形成較高分子量的蛋白質(zhì)單體[29-30]，在熱變性階段高分子量的單體不能完全展開，熱交聯(lián)過程中更易于形成隨機(jī)無序結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致形成的蛋清凝膠結(jié)構(gòu)疏松，單體較大而分布不均勻，交聯(lián)度低空洞大[31]，且隨著鹽離子含量增高，凝膠結(jié)構(gòu)可能越疏松，而孔徑可能越大，而后期凝膠持水力的增加可能與水分含量的顯著降低有關(guān)(P<0.05)[32]。

如表2所示，在腌制過程中，咸蛋黃的硬度、內(nèi)聚性和咀嚼性都在顯著增加(P<0.05)，而彈性在降低，質(zhì)構(gòu)指標(biāo)在后期逐漸穩(wěn)定；硬度、內(nèi)聚性和咀嚼性的增加，可能是鹽離子和熱誘導(dǎo)作用，使得蛋黃中成分的在疏水相互作用和二硫鍵等次級鍵的作用下結(jié)合的更加緊密[17,33]，其中，鹽離子導(dǎo)致蛋黃顆粒中的脂蛋白結(jié)構(gòu)改變，可溶性蛋白質(zhì)脫離，而脫水作用導(dǎo)致漿液的黏度增加,蛋白質(zhì)等成分因此相互靠近并結(jié)合形成聚集體[12,17]；熱誘導(dǎo)作用導(dǎo)致水分子運(yùn)動加劇，脂蛋白質(zhì)聚集體因體積較大，發(fā)生變性后的疏水鍵和巰基暴露的也較多，在熱誘導(dǎo)凝膠形成過程中，數(shù)量較多的疏水鍵和巰基結(jié)合形成緊密的脂蛋白—水—NaCl復(fù)合物[26]，因此，硬度、內(nèi)聚性和咀嚼性不斷增加。而彈性的降低可能與蛋黃中水分含量的降低和蛋黃硬度的增加有關(guān)[34]，而在腌制后期由于蛋白質(zhì)聚集體的增大和結(jié)構(gòu)緊密，焓變溫度增高，耐熱性增加，熱誘導(dǎo)對質(zhì)構(gòu)結(jié)構(gòu)的影響程度降低，質(zhì)構(gòu)特性的變化趨于穩(wěn)定[35]。

表1 蛋清質(zhì)構(gòu)特性變化?

? 同列不同字母代表樣品存在顯著差異(P<0.05)。

表2 蛋黃質(zhì)構(gòu)特性變化?

? 同列不同字母代表樣品存在顯著差異(P<0.05)。

2.5 各指標(biāo)相關(guān)性分析

由表3可知，蛋清硬度、內(nèi)聚性和咀嚼性與不易流動水(T22)和自由水(T23)存在顯著的相關(guān)性(P<0.05)[36]。蛋清凝膠中不易流動水截留在蛋清凝膠中，而自由水在凝膠孔徑中[21]，不易流動水和自由水與凝膠結(jié)合程度下降，凝膠三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的交聯(lián)度降低及其孔徑變大，因此凝膠的強(qiáng)度下降，維持其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的能力和內(nèi)部結(jié)合力變?nèi)鮗23]；持水性與自由水的積分面積、弛豫時(shí)間T23和水分含量存在顯著的相關(guān)性(P<0.05)，自由水的流動性較大越容易失去，鹽離子對蛋清蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響，導(dǎo)致凝膠中的自由水的相對含量增加，凝膠的持水性因此下降[34]，而后期由于水分含量的顯著降低(P<0.05)，凝膠的持水力也略有增加。

由表2可知，不易流動水(T22)和自由水(T23)的弛豫時(shí)間與蛋黃凝膠的硬度、內(nèi)聚性和咀嚼性存在顯著相關(guān)性(P<0.05)；腌制過程中，結(jié)合水的結(jié)合越來越緊密，表明蛋黃中的脂蛋白—水—NaCl凝膠結(jié)構(gòu)更加致密[29]，凝膠的強(qiáng)度，分子間結(jié)合力和咀嚼性也因此增加。彈性與水分含量存在顯著相關(guān)性(P<0.05)，說明蛋黃凝膠的水分含量的減少，能夠在一定范圍內(nèi)解釋凝膠彈性的降低。

? *表示P<0.05 水平差異顯著；**表示P<0.01 水平差異顯著。

表4 蛋黃各指標(biāo)間的相關(guān)性?

? *表示P<0.05 水平差異顯著；**表示P<0.01 水平差異顯著。

3 結(jié)論

本研究利用LF-NMR測定在腌制過程中咸鴨蛋水分分布狀態(tài)，并研究鹽離子對咸鴨蛋蛋清和蛋黃凝膠特性的影響，且發(fā)現(xiàn)凝膠持性與宏觀的質(zhì)構(gòu)和持水性等評價(jià)指標(biāo)存在相關(guān)性。結(jié)果表明，利用LF-NMR技術(shù)對咸鴨蛋水分含量及狀態(tài)的測定可作為預(yù)測咸鴨蛋成熟度和品質(zhì)的參考指標(biāo)，縮短咸鴨蛋檢測周期，減少原料損耗，可為工業(yè)化生產(chǎn)咸鴨蛋降低成本提供幫助。