SPME-GC-MS結合組學技術分析發酵椰奶特征風味與風味物質相關性

雷文平 周 輝 周杏榮 吳 坤吳 霓 宋艷菲 劉成國

(1. 湖南農業大學食品科學技術學院，湖南 長沙 410128；2. 食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128)

椰子(Cocosnuciferal)屬棕櫚科，是一種單子葉植被，具有較高營養與藥用價值，椰汁與椰肉富含蛋白質、脂肪、膳食纖維、維生素、鉀、鈣、鎂等營養物質[1]； 有研究[2-4]表明椰子具有抗菌、預防糖尿病、抗癌等功效。有學者[5-7]研究了椰子相關發酵制品，但仍以牛乳為原料，向其中加入椰漿進行復配發酵；并且椰子制品主要包括椰子油、椰奶、椰子水和椰子肉等；而完全以椰漿作為原料的發酵制品以及利用SPME-GC-MS對其風味成分的分析未見報道；因此，對椰漿發酵制品風味成分鑒定有待進一步研究。

固相微萃取—氣相色譜—質譜聯用技術(SPME-GC-MS)被廣泛應用于食品風味物質的研究；氣相色譜—質譜聯用技術對于高揮發性的小分子量與高沸點的大分子量的物質具有較低檢出限，并且固相微萃取(SPME)技術允許在短時間內以簡單的方式從固體和液體基質中分離揮發性物質[8-10]。目前，部分學者[11-13]利用氣相色譜—質譜聯用技術主要集中在對發酵制品風味物質的含量及種類等分析，并未將特征感官風味與風味成分結合起來分析相應風味物質貢獻的特征感官風味，而利用SPME-GC-MS結合組學技術能較準確分析發酵制品的特征感官風味與風味物質的相關性[14]。

本研究擬以發酵椰奶為主要研究對象，利用固相微萃取—氣相色譜—質譜聯用技術對發酵椰奶的風味成分進行分析，結合組學技術從感官和風味物質方面分析了發酵椰奶的特征風味，并以原味椰奶和酸牛奶作對比。旨在為發酵椰奶風味物質組成的鑒定及相關品質的改進提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

佳樂椰漿：蘇門答臘SAMBU集團；

酸牛奶：食品微生物實驗室自制，制作方法參考文獻[15]；

直投式發酵劑(Directed vat set，DVS)Y428A、Y439B、Y429A：上海昊岳食品科技有限公司；

脫脂奶粉：太子奶集團生物科技有限責任公司；

果膠：食品級，厚滿生物科技(上海)有限公司；

海藻酸丙二醇酯：食品級，鄭州億之源化工產品有限公司；

白砂糖：食品級，長沙尚杰食品有限公司。

1.2 儀器與設備

電子天平：PUCHUN型，上海精密科學儀器有限公司；

生化培養箱：GZ-400-S型，韶關市廣智科技設備有限公司；

雙人單面垂直凈化工作臺：SW-CJ-2D型，蘇州博萊爾凈化設備有限公司；

超級恒溫水浴鍋：601型，金壇市醫療器廠；

冷藏柜：SC-320D型，青島海爾股份有限公司；

氣質聯用儀：GCMS-QP2010型，島津企業管理(中國)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 發酵椰奶的制備 首先將椰漿預熱至(60±1) ℃，并向椰漿中加入果膠(0.3 g/L)、海藻酸丙二醇酯(0.9 g/L)以及白砂糖(80 g/L)，加水至所需用量，混合攪拌均勻，制備成椰奶；然后將上述椰奶在溫度60 ℃、壓力25 MPa的條件下進行一級均質處理2～3次；將均質后的椰奶在溫度95 ℃條件下殺菌處理25 min；殺菌完成后冷卻至(35±2) ℃，在無菌條件下加入30 g/L的直投式發酵劑至椰奶中，并在溫度39 ℃的條件下發酵7～8 h，待達到凝固狀態，且酸度為55～65 °T時即為發酵終點。最后，將恒溫發酵后的產品迅速冷卻至10 ℃以下，放入0～4 ℃的冰箱冷藏后熟24 h。

1.3.2 感官特征分析 將制備完成的發酵椰奶，以及原味椰奶(按1.2.1制備而成的椰奶)和酸牛奶，參照GB/T 16291.1—2012的感官評判標準，組建10人的感官評定小組。感官評價所用的描述性感官詞，來源于感官分析術語[16]和相關文獻[17]詞匯。

1.3.3 風味成分分析 將制備完成的發酵椰奶，以及原味椰奶和酸牛奶，利用固相微萃取—氣相色譜—質譜聯用技術進行風味成分分析。

1.3.4 感官特征評價方法 分別稱取20 g發酵椰奶、原味椰漿和酸牛奶放入3個品嘗杯中，對其進行氣味、滋味感官評定。每次評定的樣品編號采用3位隨機數字。評定員品嘗完一個樣品后用礦泉水漱口，每個樣品重復3次。感官評分標準(0～9分)：0分(無)；1～3分(較弱)；4～6分(中等強度)；7～9分(強)。經訓練后樣品感官風味特征描述詞為甜味、酸味、椰子味、奶香味、果香味、乳脂味、香草味、蒸煮味、醇香味、焦糖氣味[18]。

1.3.5 風味成分測定方法

(1) 樣品萃取方法：稱取按1.3.1所制備發酵椰奶、原味椰奶和酸牛奶樣品各1 g，分別置于15 mL萃取瓶，旋緊萃取瓶蓋，溫度為50 ℃條件下處理30 min, 然后利用老化后的萃取頭在溫度為70 ℃條件下頂空吸附45 min，最后插入GC-MS進樣口解吸1 min，拔出萃取頭進行GC-MS分析。

(2) GC條件：DB-WAX毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；進樣口溫度250 ℃；柱箱升溫程序：初溫35 ℃保持3 min，然后以3 ℃/min升溫至200 ℃，再以20 ℃/min升溫至250 ℃，保持5 min；載氣為氦氣He，流速為1 mL/min；進樣采用自動分流方式進行，分流比10∶1[19-20]。

(3) MS條件：EM電離源，離子源溫度250 ℃；接口溫度200 ℃；檢測電壓為1 kV；質量掃描范圍m/z為35～400[21-22]。

1.5 數據統計

采用Excel 2010軟件進行數據分析，顯著性水平為P<0.05；利用R Studio軟件對樣品進行(Principal component analysis，PCA)分析，并以Origin Pro 2018軟件作圖；采用SIMCA-P 11.5分析軟件對發酵椰奶氣味感官數據與揮發性風味物質進行偏最小二乘法分析(Partial least squares regression，PLS)。

2 結果與分析

2.1 感官風味特征評定

通過對感官評定人員進行培訓后，對發酵椰奶、原味椰奶以及酸牛奶的感官風味特征評定，評定的結果見表1。

表1 感官風味特征評定結果?

? 同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

由表1可知，發酵椰奶感官風味特征在甜味、酸味、椰子味、奶香味、乳脂味以及醇香味感官評分較高，其評分皆>3.00。對于甜味，發酵椰奶感官評分(5.70±0.45)相對于原味椰奶(8.60±0.53)顯著降低，原因可能是微生物發酵后產酸，使得發酵椰奶甜酸比發生變化；而相比酸味，酸牛奶(8.20±0.63)比較顯著。對于椰子味，椰奶在發酵前后感官評分并無顯著變化，表明微生物發酵并未削弱其特有椰子風味。同時，發酵椰奶在其它風味特征上感官評分相比酸牛奶并無顯著差異，表明發酵椰奶既保留了椰子特有風味，并且具備酸牛奶特有風味特征。

2.2 感官風味特征主成分分析

利用R Studio軟件對發酵椰奶、原味椰奶以及酸牛奶的風味感官評分進行主成分分析，其主成分載荷矩陣和PCA圖分別見表2及圖1。

對發酵椰奶、原味椰奶以及酸牛奶的風味特征感官評分進行主成分分析，前3個主成分特征值的累積貢獻率已達74.49%，能夠解釋原始變量絕大部分信息。由表2 可知，第1主成分(PC1)與甜味、酸味、椰子味以及香草味4個感官風味特征有較大相關性，其載荷絕對值均>3.5，表明PC1可以看作基本感官風味的代表。第2主成分(PC2)與奶香味、果香味和焦糖氣味3個感官風味特征有較大正相關，其載荷絕對值均>4.0，表明PC2能夠代表風味乳的特有風味。第3主成分(PC3)與奶香味和蒸煮味呈較大負相關，其載荷絕對值均>4.5，表明PC3可以看作不愉快感風味代表。

由圖1可知，發酵椰奶、原味椰奶和酸牛奶在距離上有明顯區分；發酵椰奶主要感官風味特征比較豐富，其主要集中了焦糖氣味、果香味、奶香味、椰子味和醇香味等感官風味特征；而原味椰奶和酸牛奶感官風味較為單一，且均有不愉悅的感官風味，分別為蒸煮味和酸味；同時，發酵椰奶處在原味椰奶和酸牛奶之間，進一步說明發酵椰奶既有椰子固有風味，也具備酸奶特征風味。

表2 感官風味特征主成分載荷矩陣

2.3 風味成分測定

采用SPME頂空吸附收集，GC-MS法對發酵椰奶、原味椰奶和酸牛奶的揮發性風味成分進行測定，其揮發性風味成分的總離子流圖見圖2，樣品中各類揮發成分的定性和相對定量結果如表3所示。

圖1 感官風味特征PCA圖Figure 1 Principal component biplot of sensory flavor characteristics

圖2 發酵椰奶、原味椰奶與酸牛奶揮發性風味成分總離子流圖

Figure 2 Total ion current chromatograms of volatile compounds of fermented coconut milk、natural coconut milk and yogurt

表3 不同樣品中揮發性成分?

? “-”表示樣品中該風味化合物未檢測出。

由表3可知，發酵椰奶的風味成分種類繁多，總共檢測出23種揮發性成分，其中酸類10種，醇類3種，酮類3種，醛類2種，酯類4種，其它化合物1種；原味椰奶總共檢測出18種揮發性成分，其中酸類7種，醇類2種，酮類2種，醛類1種，酯類6種；酸牛奶中總共檢測出21種揮發性成分，其中酸類9種，醇類2種，酮類4種，醛類2種，酯類4種。

酸類物質主要表現在滋味上。己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸等酸類物質相對含量較高，是影響二者滋味的重要風味成分；而相對發酵椰奶而言，丁酸、戊酸、L-乳酸是發酵椰奶的特征酸味物質，丁酸與戊酸使得發酵椰奶表現出奶油香味，L-乳酸是發酵椰奶中的主要呈味酸類，這些特殊酸類物質賦予了發酵椰奶獨特的風味[14]。

醇類物質的風味閾值較高，雖然對風味貢獻不大，但是醇類可以轉化成酸[23]。發酵椰奶中醇類物質的相對含量為6.575%，而原味椰奶和酸牛奶分別含有0.560%和5.135%；發酵椰奶中檢測出了14-甲基-8-十六碳烯-1-醇以及(+)-2,3-二氫香葉基香葉醇等醇類成分，而原味椰奶中幾乎未檢出。豐富的醇類物質使發酵椰奶表現出典型的醇香味。

原味椰奶中酮類物質含量相對較少(1.505%)，而酮類是酸牛奶的重要風味物質之一。具有奶油香味的3-羥基-2-丁酮作為酸奶制品中重要風味成分，這一成分的檢測結果差別較大，發酵椰奶中相對含量比原味椰奶和酸牛奶分別高10.295%和7.605%[24]；2,3-戊二酮具有焦糖氣味，兼具堅果果香；2-庚酮具有水果氣味。酮類物質是由不飽和脂肪酸的氧化、熱降解, 氨基酸降解或微生物代謝產生，酮類揮發性化合物一般呈奶油味或果香味[25]。

醛類物質的風味閾值一般較低，是各種氧化風味的來源[26]。發酵椰奶中醛類物質的相對含量為2.270%，原味椰奶和酸牛奶中醛類物質相對含量分別為0.325%和2.025%；壬醛具有類似蠟香、蜂蜜香風味[26]，使得發酵椰奶風味更加醇和。

酯類物質是一種很重要的風味物質，椰子脂肪是酯類物質的主要來源，主要是通過脂肪酸水解和微生物代謝產生[27]。發酵椰奶和原味椰奶的酯類物質相對含量都比較高，分別為29.850%和40.520%；相比原味椰奶，發酵椰奶中酯類物質含量明顯降低，這使得發酵椰奶滋味更加清淡柔和。

由表3還可知，含硫化合物在風味物質中很重要，風味閾值比較低，發酵椰奶中檢出1種含硫化合物，而原味椰奶和酸牛奶中并無檢出。

2.4 發酵椰奶感官氣風味特征與風味物質的相關性分析

利用SIMCA-P 11.5分析軟件對發酵椰奶風味感官數據與揮發性風味物質進行偏最小二乘法分析(PLS)，其PLS分析圖見圖3。

圖3 發酵椰奶感官氣味特征與揮發性風味物質的PLS 分析圖

Figure 3 Linear partial least-squares regressionanalysibiplot of flavor zttributes and volatile flavor compounds of fermented coconut

由圖3可知，圖中包括2個變量，分別為感官風味特征和揮發性風味物質，二者的距離越相近，表明其相關性越好，解釋性越強[28]。圖中2,3-戊二酮、3-羥基-2-丁酮和2-壬酮等風味物質主要貢獻了果香味、奶香味和焦糖氣味，與陳娟等[26]描述較為一致；14-甲基-8-十六碳烯-1-醇和(+)-2,3-二氫香葉基香葉醇主要貢獻在醇香味上，且表3中二者相對含量也相對較高，進一步表明醇香味主要由這2種物質貢獻；酸味主要由丁酸、己酸等各種脂肪酸貢獻；癸酸乙酯、δ-葵內酯、丁位壬內酯、月桂酸乙酯等酯類主要貢獻了香草味、甜味、椰子味和蒸煮味。綜上所述，酮類物質主要貢獻給發酵椰奶奶香味，酸味主要由脂肪酸貢獻；椰奶在發酵過程中產生了不佳風味如蒸煮味等，其與酯類化合物有密切關系。

3 結論

利用組學技術從感官和風味物質方面分析了發酵椰奶的特征風味，并與原味椰奶和酸牛奶進行對比。通過主成分分析表明發酵椰奶主要集中在甜味、酸味、椰子味、奶香味、乳脂味以及醇香味等感官風味特征，其感官評分均>3；而相比原味椰奶，其感官風味顯著得到改善，尤其消除了原味椰奶的蒸煮味。同時，發酵處理對原味椰漿風味成分影響顯著，從發酵椰奶中共檢測出23種風味成分，比原味椰奶和酸牛奶分別多5種和2種，相比原味椰奶，發酵椰奶中酸類和酯類成分顯著下降，而醇類、酮類和醛類成分明顯上升。進一步結合感官風味特征進行PLS分析發現發酵椰奶中2,3-戊二酮、3-羥基-2-丁酮和2-壬酮等風味物質與果香味、奶香味和焦糖氣味相關性較強，而蒸煮味主要由酯類物質貢獻，也說明通過發酵降低了酯類物質成分，能改善原味椰漿的蒸煮味。本研究利用SPME-GC-MS結合組學技術分析發酵椰奶的特征感官風味與風味物質相關性，而在研究風味物質的形成機理以及相關感官風味與風味物質聯系機制方面有待進一步研究。