高良姜醇提物的抗氧化、酶抑制活性及其與活性成分的相關性

李 姣 張曉峰 王霄凱 王婉愉

(鄭州大學公共衛生學院，河南 鄭州 450001)

高良姜是姜科山姜屬植物高良姜 (AlpiniaofficinarumHance) 的干燥根莖，也稱為高涼姜、佛手根、小良姜、良姜，主要生長于廣東、廣西、福建、云南等地[1]，為藥食同源植物。國內外研究[2-3]表明，高良姜具有抗菌鎮痛、抗炎、抗腫瘤、抗增殖、抗氧化、抗腹瀉等多種生理功能，也可作為抗氧化劑應用于食品的貯藏[4]，已被應用于食品調味料、香料和保健品等方面[5-6]。

氧化應激是指機體新陳代謝過程中活性氧和活性氮的產生與清除失衡，導致活性氧和活性氮產生過多，造成機體組織細胞和生物大分子損傷，是許多疾病發生的重要因素[7]，因此提高機體抗氧化能力有助于維持機體的健康水平。多酚和黃酮類化合物是高良姜中的主要生物活性成分之一[8]。研究[9-10]表明植物多酚能降低機體活性氧水平，并可通過抗炎、抗誘變和抗血栓等功能促進機體健康。黃酮是多酚類化合物家族中非常重要的成員，同樣具有抗氧化及抗腫瘤等方面的功能。胰脂肪酶與α-葡萄糖苷酶均為消化吸收過程中的關鍵酶，在機體的許多代謝過程中發揮著重要作用，與肥胖、糖尿病、動脈硬化等由機體代謝失調引發的疾病有密切關系[11]。若對二者酶活性進行抑制可減少機體對膳食碳水化合物和脂類的消化吸收，從而達到防治代謝相關疾病的目的。

目前高良姜的相關研究主要集中在組分提取、分離鑒定以及抑菌[12]、抗炎[13]和抗腫瘤方面[14]，而對胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的研究較少。王輝等[15]僅對高良姜不同部位乙醇提取物的α-葡萄糖苷酶活性抑制作用進行研究。本研究擬以高良姜為原料，通過對其甲醇提物中多酚和總黃酮含量、抗氧化活性以及對胰脂肪酶與α-葡萄糖苷酶的抑制活性的測定，探討高良姜體外抗氧化活性及其在調節糖脂代謝方面的能力，以期為高良姜的進一步開發利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

新鮮高良姜：市售，經鄭州大學藥學院中藥教研室教授鑒定為姜科植物高良姜。

1.2 試劑及儀器

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼 (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH)、2,2’-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽[2,2’-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonate)，ABTS]、2,4,6-三(2-吡啶基)三嗪 [2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine，TPTZ]、α-葡萄糖苷酶 [酶活力≥10 U/mg]、胰脂肪酶(酶活力30～90 U/mg)：分析純，美國Sigma公司；

槲皮素、沒食子酸 (gallic acid, GA)、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷 (4-Nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG)、Tris-HCl：分析純，上海阿拉丁試劑公司；

其他試劑：分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；

真空冷凍干燥機：LGJ-18B型，北京四環科學儀器廠有限公司；

電熱鼓風干燥箱：10-2BS型，天津市華北實驗儀器有限公司；

旋轉蒸發器：RE-2000型，上海亞榮生化儀器廠；

臺式離心機：5424R型，艾本德中國有限公司；

多功能微孔板讀數儀：Spectra Max M2e型，美谷分子儀器有限公司；

電子分析天平：AL204 型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品甲醇提取物的制備 將新鮮高良姜放于冷凍干燥機中凍干，粉碎過篩(60目)，使用CCl4在通風櫥中脫脂[1∶10 (g/mL) ] 24 h，抽濾晾干。稱取15 g脫脂干粉，加150 mL甲醇，浸提24 h后抽濾；重復浸泡2次，濾液合并濃縮冷凍干燥。稱取凍干粉0.5 g，加1 mL甲醇配成500 mg/mL樣品提取液，4 ℃儲存。

1.3.2 多酚和總黃酮含量的測定 多酚含量的測定參照Ainsworth等[16]的方法，結果以每克干粉所含的沒食子酸當量 (mg GAE /g DW) 表示。總黃酮含量的測定根據Arvouet-Grand等[17]的方法，并修改如下：取100 μL待測提取液并梯度稀釋，加入等量的2% AlCl3甲醇溶液，25 ℃靜置10 min，于415 nm波長處測量吸光度，最終以每克干粉所含的槲皮素當量 (mg QE /g DW) 表示。

1.3.3 抗氧化活性的測定

(1) DPPH自由基清除能力的測定：參照Cheng等[18]的方法，DPPH自由基離子的清除率按式(1)計算。

(1)

式中：

c—— DPPH自由基離子清除率，%；

m1—— 100 μL DPPH溶液+100 μL樣品液的吸光度值；

m2—— 100 μL甲醇溶液+100 μL樣品液的吸光度值；

m0—— 100 μL DPPH溶液+100 μL甲醇溶液的吸光度值。

(2) ABTS自由基清除能力的測定：參照Ali等[19]的方法，并對ABTS自由基離子清除率計算公式稍作修正，見式(2)。

(2)

式中：

c—— ABTS自由基離子清除率，%；

m1—— 180 μL ABTS+·工作液+20 μL樣品液的吸光度值；

m2—— 180 μL乙醇溶液+20 μL樣品液的吸光度值；

m0—— 20 μL乙醇溶液+180 μL ABTS+·工作液的吸光度值。

(3)鐵離子還原能力的測定：參照Sreerama等[20]的方法，結果用每克樣品干重中相當于Fe2+的微摩爾數 (μmol Fe2+/g DW)值表示。

1.3.4 代謝關鍵酶抑制活性的測定

(1) 胰脂肪酶抑制活性的測定：參照Mcdougall等[21]的方法，并修改如下：于1.5 mL離心管中加入50 μL樣品提取液并梯度稀釋，再加150 μL酶工作液與350 μL 0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液 (pH=8.2)，37 ℃預熱10 min 后加入450 μL底物工作液，37 ℃下反應2 h。反應終止后，16 000 r/min離心3 min，移取300 μL上清液至96孔板，測定405 nm波長處的吸光度。胰脂肪酶活性的抑制率按式(3)計算。

(3)

式中：

c—— 胰脂肪酶活性抑制率，%；

m1—— 50 μL樣品液+150 μL酶工作液+350 μL Tris-HCl緩沖液+450 μL底物工作液的吸光度值；

m2—— 以150 μL Tris-HCl緩沖液替代酶工作液的吸光度值；

m3—— 以50 μL甲醇替代樣品液的吸光度值；

m4—— 以50 μL甲醇替代樣品液，150 μL Tris-HCl緩沖液替代酶工作液的吸光度值。

(2)α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定：參照Kang等[22]的方法，α-葡萄糖苷酶活性的抑制率按式(4)計算。

(4)

式中：

c——α-葡萄糖苷酶活性抑制率，%；

m1—— 8 μL樣品液+20 μL酶工作液+112 μL PBS緩沖液+20 μL底物工作液的吸光度值；

m2—— 以20 μL PBS緩沖液替代酶工作液的吸光度值；

m3—— 以8 μL甲醇替代樣品液的吸光度值；

m4—— 以8 μL甲醇替代樣品液，以20 μL PBS緩沖液替代酶工作液的吸光度值。

1.4 數據分析與統計

采用Microsoft Excel 2016對數據進行整理，使用SPSS 21.0軟件進行單因素方差分析。所有試驗均重復3次，結果以平均值和標準差表示。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 高良姜醇提物中多酚與總黃酮的含量測定結果

2.1.1 高良姜醇提物中多酚的含量 由圖1 可知，當質量濃度在0～250 μg/mL時，沒食子酸與吸光度值的線性關系較好。測得高良姜醇提物中多酚含量為62.91 mg GAE/g DW。

2.1.2 高良姜醇提物中總黃酮的含量 如圖2所示，當質量濃度在0～200 μg/mL時，槲皮素與吸光度值的線性關系較好。測得高良姜醇提物中總黃酮含量為13.12 mg QE/g DW。

2.2 高良姜醇提物的抗氧化活性

2.2.1 DPPH自由基清除能力 高良姜醇提物對DPPH自由基清除能力如圖3所示。由圖3可知，高良姜醇提物濃度在6.25～50.00 mg/mL時，其對DPPH自由基的清除能力隨著濃度的增大而增大(Y=23.053lnX+7.307 8，R2=0.98，P<0.01)，且各濃度的清除率之間的差異有統計學意義(P<0.05)。當高良姜醇提物濃度達到50 mg/mL 時，其對DPPH自由基的清除率達到最大值95.78%。醇提物的對DPPH自由基的半抑制濃度IC50值為6.37 mg/mL。若IC50值≤10 mg/mL，可以認為該物質的抗氧化功能較好[23]，因此高良姜醇提物對DPPH自由基離子的清除能力較強。石雪萍等[24]的研究同樣發現高良姜總黃酮具有DPPH自由基清除活性，且抗氧化能力呈質量濃度依賴性。

圖1 沒食子酸標準曲線Figure 1 Standard curve of GA

圖2 槲皮素標準曲線Figure 2 Standard curve of quercetin

不同字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2.2 ABTS自由基清除能力 高良姜醇提物對ABTS自由基清除能力如圖4所示。由圖4可知，高良姜醇提物濃度在1.56～50.00 mg/mL時，其對ABTS+·的清除能力隨著濃度的增大而增大(Y=18.394lnX+37.751，R2=0.89，P<0.01)，在高良姜醇提物濃度達到25 mg/mL 時，對ABTS+·的清除能力達到98.47%，之后隨濃度的增長其清除能力趨于平穩。醇提物的對ABTS自由基的半抑制濃度IC50值為2.24 mg/mL，說明醇提物對ABTS自由基的清除能力較強。K?se等[25]分別使用水和乙醇對高良姜進行提取，結果顯示2種提取物均表現出了ABTS自由基離子的清除能力，但乙醇提物的自由基離子清除能力較強。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2.3 鐵離子還原能力 以FeSO4濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制FeSO4標準曲線。如圖5所示，濃度在0～1 000 μmol/L時FeSO4濃度與其在593 nm處的吸光度呈良好的線性關系。高良姜醇提物的FRAP值為428.92 μmol Fe2+/g DW。

2.3 高良姜醇提物對代謝關鍵酶的抑制活性

2.3.1 胰脂肪酶抑制活性 高良姜醇提物對胰脂肪酶的抑制活性如圖6所示。從圖6可知，高良姜醇提物對胰脂肪酶具有較好的抑制活性，當濃度為62.5 mg/mL時，對胰脂肪酶的抑制率較低 (12.42%)，但隨著濃度的增大，其抑制活性逐漸增強，IC50值為205.87 mg/mL。曲線回歸分析表明在此濃度范圍內，對胰脂肪酶抑制活性呈現質量濃度依賴性(P<0.05)。

圖5 FeSO4標準曲線Figure 5 Standard curve of FeSO4

圖6 高良姜醇提物對胰脂肪酶抑制活性Figure 6 Pancreatic lipase activity Inhibition of methanol extract of Galangal

2.3.2α-葡萄糖苷酶抑制活性 高良姜醇提物對α-葡萄糖苷酶抑制活性如圖7所示。由圖7可知，高良姜醇提物濃度在62.50～500.00 mg/mL時，對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率隨著質量濃度的增大而增大，IC50值為1.32 mg/mL，說明在此濃度范圍內高良姜醇提物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用與提取物濃度有明顯的相關性，并且各濃度下的α-葡萄糖苷酶抑制率之間的差異有統計學意義(P<0.05)。

圖7 高良姜醇提物對α-葡萄糖苷酶抑制活性Figure 7 α-glucosidase activity inhibition of methanol extract of Galangal

已有研究表明姜科植物在降糖方面具有較好功效，如生姜[26]、姜黃[27]、草果[28]等在胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶活性抑制方面都有較強的功能，表現出了較好的降血脂、抗糖尿病效果。本研究也發現姜科植物高良姜表現出較好的胰脂肪酶、α-葡萄糖苷酶抑制活性，且均呈現一定的濃度依賴性。

2.4 高良姜醇提物生物活性與其多酚和總黃酮含量的相關性分析

為進一步探討高良姜醇提物的抗氧化能力和酶抑制功能來源，本試驗對高良姜醇提物抗氧化能力、胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性與其多酚、總黃酮含量的相關性分析結果見表1。

表1高良姜醇提物生物活性與其多酚、總黃酮含量的相關性分析?

Table 1 Correlation analysis between bioactivities and polyphenols and flavonoids of methanol extract of Galangal

自由基及酶相關系數 r多酚總黃酮DPPH+·清除能力0.992?0.968?ABTS+·清除能力0.996?0.927?鐵離子還原能力(FRAP)0.941?0.887?α-葡萄糖苷酶0.976?0.858?胰脂肪酶0.990?0.942?

? *表示有統計學意義(P<0.05)。

由表1可知，高良姜醇提物多酚和總黃酮含量均與其3種抗氧化指標、胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性呈正相關 (P<0.05)，說明高良姜醇提物的體外生物學活性與其多酚、總黃酮含量有密切聯系。多酚和黃酮可能是高良姜醇提物中具有抗氧化活性、胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性成分的重要組成部分。

3 結論

作為藥食兩用的植物資源，高良姜醇提物中多酚和總黃酮含量豐富，在測定的質量濃度范圍內，高良姜醇提物清除DPPH和ABTS自由基能力以及鐵離子還原能力較好，對胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性隨質量濃度的增高而增大。說明高良姜醇提物具有較好的抗氧化活性和代謝關鍵酶抑制活性，在天然抗氧化劑、降血糖降血脂藥物以及功能性食品的開發與應用方面具有很好的前景。但本試驗尚未對醇提物做進一步的分離鑒定，其發揮功能的主要成分有待進一步研究。