谷氨酰胺轉氨酶處理對鴨血豆腐品質的影響

王 斌 陳希玲

(1. 江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；2. 江蘇省食品安全與質量控制協同創新中心，江蘇 無錫 214122)

鴨血豆腐是以新鮮鴨血為原料，加入水、食鹽等配料，經過促凝、蒸煮殺菌、冷卻成型等工藝流程制成的一種凝膠態食品。傳統鴨血豆腐的生產主要依靠小作坊手工制作，所得產品均一程度不高，衛生安全也得不到保障[2]。目前，市售的鴨血豆腐以冷藏方式為主，仍存在貨架期短、起孔、色澤暗等問題。

谷氨酰胺轉氨酶(Transglutaminase，TG)是一種通過催化酰基轉移反應加速蛋白質共價交聯的酶，具有來源廣泛、反應條件溫和、對營養成分破壞小等特點。TG能夠催化蛋白質中谷氨酰胺殘基與賴氨酸之間的酰基轉移反應，形成空間網絡結構。通過改善蛋白質的結構與特性賦予產品更好的質構特性，提高食品的凝膠性與可塑性。Li等[3]研究了TG對豬肉和魚糜混合物質量和凝膠特性的影響，發現0.4% TG不僅可以改善相同肉蛋白之間的交聯，還能增強豬肉和鰱魚蛋白質之間的協同作用，為提高肉制品質量提供思路。

本試驗擬研究谷氨酰胺轉氨酶反應條件對鴨血豆腐品質的影響，并通過單因素和正交試驗優化確定最佳的酶處理方式，為運用谷氨酰胺轉氨酶改善鴨血豆腐的加工品質提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

新鮮鴨血：無錫市錫南路農貿菜場；

谷氨酰胺轉氨酶：最適溫度40～45 ℃，pH 6.0～7.0，泰興市東圣食品科技有限公司；

氯化鈉、檸檬酸鈉、氯化鈣、戊二醛、磷酸鹽、無水乙醇：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

恒溫水浴鍋：DK-8AXX型，上海森信實驗儀器有限公司；

物性分析儀：TA.XT2i型，英國Stab.Micro Systems公司；

高精度分光測色儀：UltraScan Pro1166型，美國Hunterlab公司；

高速落地離心機：Sorvall LYNX6000型，德國Thermo公司；

低場核磁共振分析儀：MesoMR23-060V-I型，蘇州紐邁分析儀器股份有限公司；

真空干燥箱：DZF-6020型，上海森信實驗儀器有限公司；

掃描電子顯微鏡：su1510型，日本日立株式會社。

1.2 方法

1.2.1 鴨血豆腐工藝流程

鴨血抗凝→加入鹽溶液，調節pH至中性→添加TG→抽氣→40 ℃保溫→促凝→蒸煮→冷卻→貯藏[4]15

1.2.2 操作要點

(1) 鴨血抗凝：選取檸檬酸鈉為抗凝劑，每50 mL鮮鴨血中加入1%抗凝劑50 mL后攪拌均勻。

(2) 抽氣：將全血置于真空干燥箱中，40 ℃、真空度0.08 MPa抽10 min。

(3) 促凝：選取氯化鈣為凝固劑，每15 mL鴨血與抗凝劑的混合液中加入1%的凝固劑1 mL。

(4) 保溫：谷氨酰胺轉氨酶的最適溫度范圍是40～45 ℃。王芳等[5]將谷氨酰胺轉氨酶于40 ℃條件下保溫，探究加酶量等因素對豬血漿蛋白凝膠特性的影響，故本研究選定酶作用溫度為40 ℃。

(5) 蒸煮、冷卻：90 ℃水浴加熱30 min后立刻放入冰水混合物中冷卻至室溫，然后置于4 ℃下保存過夜。

1.2.3 單因素試驗

(1) 酶添加量對鴨血豆腐品質的影響：取40 mL鴨血混合液6份，在保溫時間40 min的條件下，按質量比分別添加0.00%，0.10%，0.15%，0.20%，0.25%，0.30%的TG，進行質構、色差、持水力、蒸煮損失的測定，比較酶添加量對鴨血豆腐品質的影響。

(2) 保溫時間對鴨血豆腐品質的影響：取40 mL鴨血混合液6份，添加0.20% TG，分別在40 ℃下保溫0，20，40，60 min，進行質構、色差、持水力、蒸煮損失的測定，比較保溫時間對鴨血豆腐品質的影響。

1.2.4 酶處理條件優化 根據單因素試驗結果，進一步采用正交試驗方案進行優化。以蒸煮損失率為指標，確定酶量和保溫時間的最優參數組合。

1.2.5 持水力測定 稱取1.000 0 g鴨血豆腐置于2 mL離心管中，于4 ℃、10 000×g離心15 min，取出后先用移液槍吸去上層水分，再用濾紙擦拭表面水分，記錄離心管的總質量。按式(1)計算持水力：

(1)

式中：

WHC——持水力，%；

W——空離心管的重量，g；

W1——為離心前離心管+鴨血豆腐的重量，g；

W2——去除離心水分后離心管+鴨血豆腐的重量，g。

1.2.6 蒸煮損失測定 根據文獻[6]，修改如下：稱取蒸煮前鴨血豆腐的質量記為m1，于自封袋中封口，沸水蒸煮5 min后撈出冷卻，蒸煮后鴨血豆腐的質量記為m2，按式(2)計算蒸煮損失率。

(2)

式中：

ω——蒸煮損失率，%；

m1——蒸煮前的質量，g；

m2——蒸煮后的質量，g。

1.2.7 全質構(TPA)測定 將Φ15 mm×8 mm的圓柱體樣品放于物性儀載物臺，采用TPA模式對樣品進行二次壓縮。參數設定：探頭型號P/35，測前速率2.0 mm/s，測中速度1.0 mm/s，返回速率5.0 mm/s，兩次下壓之間間隔5 s，壓縮比50%，觸發力Auto-5 g，每組樣品重復測定5次。

1.2.8 紅度測定 根據文獻[7]，采用標準測色儀測定魚糜凝膠的亮度L*、紅度a*、黃度b*值。

1.2.9 橫向弛豫時間(T2)測定及弛豫數據反演 選用CPMG序列測定鴨血豆腐凝膠的橫向弛豫時間T2。切取1～2 g塊狀樣品，處理后放入核磁共振儀中25 mm的直徑核磁管并進行分析。測試參數設置：質子共振頻率為21 MHz，30 ℃下測量。

1.2.10 微觀結構分析 根據文獻[8]，修改如下：將鴨血豆腐樣品切成規格為4 mm×4 mm×4 mm的立方體，在pH 7.2、體積分數2.5%的戊二醛中進行前固定，再用pH 7.2、0.1 mol/L的磷酸緩沖液洗滌3次，每次間隔30 min；然后分別用30%，50%，70%，80%，90%的乙醇進行梯度脫水3次，每次15 min；接著用無水乙醇脫水3次，每次持續15 min。將處理后的樣品置于-20 ℃預冷的真空冷凍干燥機中干燥27～28 h，噴金處理后用掃描電子顯微鏡進行凍干鴨血豆腐的微觀結構觀察。

1.2.11 數據處理與分析 通過軟件SPSS 19.0的單因素方差分析和LSD后特設測試(最小顯著差異)對數據進行統計分析，采用Excel、Origin進行圖表處理。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗條件優化

2.1.1 TG添加量對鴨血豆腐品質的影響

(1) 持水力和蒸煮損失：持水性是反映蛋白凝膠穩定性的重要參數[9]。蒸煮損失主要損失的是水，因此持水性較高的樣品蒸煮損失率相應較低。由表1可知，0.10%～0.15% TG時，持水性下降，0.20%～0.30% TG時持水性改善最佳。這是因為TG促進蛋白質分子內或分子間的交聯形成牢固的凝膠網絡結構，截留了大量的水，從而提高了鴨血豆腐持水性。但繼續添加TG，持水性變化不大，可能是蛋白質濃度是固定的，TG濃度增加的同時底物濃度并未隨之增加，因此無法促進更多的蛋白質發生交聯，截留的水分含量也就變化極微。

(2) 全質構：不同添加量的TG能夠影響鴨血豆腐的質構特性，其對硬度、彈性、內聚性、回復性的影響不顯著；但膠著性卻隨著酶添加量的增加而顯著增加(表2，P<0.05)，在添加量0.25%時達到最高值691.99，較空白組增加了57.40%。膠著性是模擬樣品破裂成吞咽狀態時所需要的能量，它反映的是分子間結合作用的強弱或者樣品在抵抗外界損壞時保留自身完整性的能力，該數值的上升說明TG的存在促進了血漿蛋白之間的交聯，賦予鴨血豆腐更好的韌性。因此添加0.25% TG的鴨血豆腐在運輸過程中更能經受外界的損壞。

表1 TG添加量對鴨血豆腐持水力和蒸煮損失的影響?

Table 1 Effects of TG dosage on WHC and stewing loss of duck blood tofu %

? *表示與空白組比較，P<0.05。

表2 TG添加量對鴨血豆腐全質構的影響?

? *表示與空白組比較，P<0.05。

(3) 色度：L*和a*對人的感官影響更為密切，應當作為評價鴨血豆腐品質的主要參考指標[4]36。由表3可知，添加TG后紅度顯著增加，添加量在0.15%以后紅度值趨于穩定，因此添加TG能夠有效改善鴨血豆腐顏色暗沉的情況。

硬度與樣品的保水性等相關，內聚性反映鴨血豆腐的完整性、韌性，是質構測定時的重要參數。TG添加量0.25%時，鴨血豆腐質構特性最好，色澤暗沉的問題也得以改善，該水平下的鴨血豆腐持水力優于空白，因此選擇0.25%作為最佳酶處理量。

表3 TG添加量對鴨血豆腐色度的影響?

? *表示與空白組比較，P<0.05。

2.1.2 保溫時間對鴨血豆腐品質的影響

(1) 持水力和蒸煮損失：由表4可知，持水性和蒸煮損失率的變化趨勢基本保持一致，二者在40 min 前呈上升趨勢，繼續保溫至60 min時反而有所下降，但差異性不顯著(P>0.05)。說明保溫時間對鴨血豆腐持水力和蒸煮損失率的影響不大。

表4 TG保溫時間對鴨血豆腐持水力和蒸煮損失的影響

(2) 全質構：由表5可知，與空白組相比，不同保溫時間下的鴨血豆腐在彈性、膠著性、內聚性、回復性4個指標上并無顯著差異(P>0.05)，說明在添加相同量谷氨酰胺轉氨酶的情況下，保溫時間的改變對鴨血豆腐彈性、膠著性、內聚性、回復性的影響不大。但硬度隨保溫時間延長而增大，40 min時達到最大值(869.70)，40 min 以后又出現回落，可能是保溫時間過長導致已經完成交聯的蛋白質凝膠劣化，因此硬度有所下降。

(3) 色度：由表6可知，試驗組鴨血豆腐的紅度均顯著高于空白組(P<0.05)。添加0.20% TG于40 ℃保溫條件下，紅度a*在40 min左右達到最大值(10.22)，此時色澤是最好的。

表5 保溫時間對鴨血豆腐全質構的影響?

? *表示與空白組比較，P<0.05。

表6 保溫時間對鴨血豆腐色度的影響?

? *表示與空白組比較，P<0.05。

根據硬度和色度的相關指標，保溫40 min的鴨血豆腐產品質量優于其他試驗組，因此保溫時間選擇40 min為宜。

2.2 酶處理條件的正交優化

2.2.1 正交優化試驗 為進一步優化加酶處理鴨血豆腐的生產工藝，根據單因素試驗結果，選擇加酶量、保溫時間做兩因素三水平正交試驗(表7)。分析正交處理鴨血后所得產品的蒸煮損失率，從而進一步確定最佳酶處理方式。試驗設計及結果見表8。由表8可知，因素影響的主次關系為加酶量>保溫時間，最優組合為A2B1，即添加0.25% TG，40 ℃下保溫30 min。

2.2.2 最佳組合的驗證實驗

(1) 弛豫時間與水分分布：低場核磁測試作為一種新型的無損檢測方法可以監測食品中的水分狀態和移動情況，為提高產品的穩定性提供了有力的保證[10]。由表9可知，不同處理方式的鴨血豆腐凝膠在1～10 000 ms內T2分布出現了4個峰，這4個峰代表了4個組分，T21(<1 ms)、T22(<10 ms)是最難遷移的水，即與大分子緊密結合的水，根據蛋白結合水性質的微弱不同可以分為結構結合水和吸附結合水，T23是滯留于凝膠網絡結構中不易移動的水，T24為鴨血凝膠中的自由水。

表7 正交因素水平

表8 正交試驗設計與結果

T2弛豫時間是對樣品內部氫質子所處化學環境的反映，它與氫質子所受束縛力大小及其自由度有關。當氫質子所受束縛越大或自由度越小，則T2弛豫時間越短，在T2譜上峰出現的位置越靠左；反之T2弛豫時間越長，峰位置則越靠右[11]。試驗組鴨血凝膠T23弛豫時間整體較空白組向左遷移，這說明添加TG酶處理后鴨血豆腐內部的水分受到的束縛力增加，其中加入TG酶處理使T23和T24明顯降低，這表明不易流動水分子和自由水的移動性顯著降低，從而證明谷氨酰胺轉氨酶的加入促使水分結合地更緊密。

表9 處理方式對鴨血凝膠弛豫時間的影響?

? *表示與空白組比較，P<0.05。

鴨血凝膠保水性主要取決于不易移動水。鴨血豆腐保水性的變化也正是因為自由水減少、結合水上升所引起的。這可能是交聯過程中蛋白質的親水基團暴露，使自由水轉化為不易移動水。如圖1所示，0.25%TG+40 ℃ 下保溫處理30 min的鴨血豆腐中自由水含量減少，結合水與不易移動水占比增加最為顯著。這是因為TG酶增加了蛋白之間的交聯，形成致密的網絡結構，包合更多的水分，因此鴨血豆腐品質也是最優的。

(2) 全質構測定：由表10可知，第4組(0.25% TG+30 min)鴨血豆腐內聚性和回復性分別為0.90和0.42，均達到最高水平，說明添加0.25% TG，保溫30 min促進了蛋白交聯，但又不至于過分交聯導致鴨血豆腐韌性過大，因此該處理方式下的鴨血豆腐的品質優于其他組。

0. 未添加TG未保溫 1. 0.20% TG+30 min 2. 0.20% TG+40 min 3. 0.20% TG+50 min 4. 0.25% TG+30 min 5. 0.25% TG+40 min 6. 0.25% TG+50 min 7. 0.30% TG+30 min 8. 0.30% TG+40 min 9. 0.30% TG+50 min

圖1 處理方式對各峰峰面積百分數的影響

? *表示與空白組比較，P<0.05。

(3) 微觀結構：較強凝膠強度形成的原因是存在規則的結構。由圖2可以觀察到天然狀態下形成的鴨血凝膠體系是由纖維蛋白形成的錯綜復雜的網狀結構，孔徑較大、雜亂無章，水分容易滲漏。這種粗糙、不規則的網狀結構會導致不理想的硬度、口感。加入0.25% TG、40 ℃下保溫30 min的鴨血凝膠中蛋白質交聯、堆積在自身凝膠體系中，形成更均一、緊密的網絡結構，該凝膠結構網孔變小，能夠有效包合水分，防止鴨血豆腐脫水皺縮[12]，也賦予產品較好的可塑性。

圖2 鴨血豆腐的掃描電鏡圖

Figure 2 Scanning electron micrographs of duck blood curd by different methods (×5 000)

3 結論

利用單因素試驗研究了加酶量、保溫時間對鴨血豆腐的質構、顏色、持水性等指標的影響，通過兩因素三水平正交試驗對條件進行優化，確定最佳的酶處理方式為：添加0.25% TG并在40 ℃下保溫30 min。利用此優化條件進行實驗驗證，最終所得鴨血豆腐的持水性提高、膠著性、內聚性等質構特性得到明顯改善。食用膠具有改善蛋白熱誘導凝膠的特性，后續可進一步探究谷氨酰胺轉氨酶與食用膠復配對鴨血豆腐品質的影響。