沉默ADAM17 對HT29 人結腸癌細胞體外侵襲能力的影響及機制探究

張琪，楊光華，黃志強，葛志鵬，劉少鵬，田煒，張國志，王長友

（1.華北理工大學附屬醫院，河北 唐山 063000；2，華北理工大學 醫學實驗中心，河北 唐山 063000）

結腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，我國結腸癌的發病率呈上升且年輕化發展趨勢[1-2]。腫瘤壞死因子α 轉換酶，又稱解聚素-金屬蛋白酶17（adisintegrin and metalloprotease 17,ADAM17）[3]，有著水解剪切酶類作用，在腫瘤的發生、發展起著重要作用，且對腫瘤患者的生存預后有一定的提示意義[4-5]。惡性侵襲和轉移是腫瘤細胞惡性病因的原因之一。因此，本研究通過抑制HT29 人結腸癌細胞ADAM17 的表達，探討其對HT29 人結腸癌細胞體外侵襲的影響作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

HT29 人結腸癌細胞株（購自中國科學院干細胞庫），DMEM 培養基、胎牛血清、胰酶（美國Gibco 公司），Trizol、Go ScriptTM逆 轉 錄 試 劑 盒、real-time PCR 試劑盒（美國Invitrogen 公司），Transwell 小室、Matrigel膠（美國BD 公司），抗體ADAM17（美國Abcom 公司），磷酸化細胞外調節蛋白激酶（phosphorylation extracellular regulated protein kinases,p-ERK）、細胞外調 節 蛋 白激酶（extracellular regulated protein kinases,ERK）、基質金屬蛋白酶-9（matri metalloproteinase-9,MMP-9）及β-actin 抗體（美國Sigma 公司），HR 標記山羊抗兔IgG 二抗、DAB 顯影液（上海碧云天生物技術研究所），BCA 蛋白濃度測定試劑盒、RIPA 裂解液、PMSF、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），酶標儀、濕轉系統（上海Bio-Rad公司）。

1.2 細胞培養及慢病毒轉染

HT29 細胞用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養基，在5%二氧化碳CO2，37.0 ℃條件孵育箱中 培 養。ADAM17 小 干 擾RNA（ADAM17-shRNA） 由上海吉瑪公司合成，序列如下：轉染組，5'-GCATCAT GTATCTGAACAACG-3'；無意義序列組，5'-TTCTCCG AACGTGTCACGT-3'。

HT-29 細胞的轉染組（ADAM17-shRNA）和無意義序列組（nonsense shRNA）根據使用說明書在進行轉染時加入5 μg/ml 聚凝胺（Polybrene）?？瞻讓φ战M加入等量的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline,PBS），轉染后48 h 熒光顯微鏡下觀察轉染效率。

1.3 慢病毒沉默ADAM17 表達的檢測

根據病毒轉染說明書，細胞轉染后48 h，收集各組細胞，Trizol 法提取RNA。通過Go ScriptTM逆轉錄試劑盒將RNA 逆轉錄為cDNA。然后進行實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）。引物序列設計如下：ADAM17 正向引物：5'-ATCAAACCTTTCCTG CG-3'，反向引物：5'-CAAACCCATCCTCGTCCA-3'；GAPDH正向引物：5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，反向引物：5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3。

PCR 儀器進行以下循環：95℃變性2 min，45℃退火30 s，60℃延伸60 s，共40 個循環。根據qRTPCR 體系參照GAPDH 做為內參的表達水平來檢測HT29 結腸癌細胞的ADAM17 mRNA 表達水平。每組設2 個副孔，平行實驗3 次。采用相對定量法（CT 法）分析所得數據，ADAM17 shRNA 轉染后細胞mRNA 相對表達量=2-△△Ct。

1.4 細胞遷移能力檢測

利用單層細胞劃痕損傷修復實驗檢測細胞遷移能力，細胞轉染后48 h，HT29 細胞在對數生長階段制備成單細胞懸液，按照轉染組、無意義序列組和空白對照組以每孔1×105個接種于6 孔板上，培養12 h使形成單層細胞。用200 μl 移液槍槍頭在單層細胞上水平劃出一道痕跡，用PBS 清洗3 次，加入含有10% FBS的DMEM培養基 37℃培養24 h。吸去培養液，用PBS 清洗3 次后，在倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄。Image J 軟件分析遷移面積。實驗均重復進行3 次。

1.5 Transwell 體外侵襲實驗

通過觀察穿過Matrigel 膠的細胞數量檢測不同處理對于結腸癌細胞侵襲能力的影響。HT29 細胞在對數生長階段用不含有FBS 的培養基饑餓培養12 h，以同步化細胞，然后制備成細胞懸液。將Matrigel 膠與DMEM 按照1 ∶8 稀釋，取出70 μl 覆蓋在Transwell小室底部膜的上室面，置于37℃下30 min，使Matrigel聚合成凝膠。按照空白對照組，無意義序列組和轉染組以每孔1×104個，體積為200 μl 的細胞懸液接種于Transwell 小室的上室。下室加入750 μl 含FBS的DMEM 培養基。培養箱中培養24 h。去掉上室的Matrigel 膠，4%甲醛固定液中30 min，蘇木精-伊紅染色1 min 后PBS 沖洗3 次，顯微鏡下隨機選取3 個視野進行細胞計數。重復進行3 次獨立操作加以驗證。

1.6 Western blotting 檢測相關蛋白表達

取轉染后48 h 各組細胞，RIPA 裂解液裂解，離心收集蛋白。BCA 法定量總蛋白，加入等體積2×蛋白上樣緩沖液后100℃變性5 min，置入-80℃冰箱冷凍保存備用。進行SDS-PAGE 蛋白電泳，再分別進行轉膜（90 V，90 min），10%脫脂奶封閉，一抗孵育過夜（1 ∶1 000），二抗（1 ∶1 000）37℃孵育2 h，上機熒光顯色。Image J 軟件分析灰度值。相關蛋白表達量計算=（所測蛋白灰度值/內參灰度值）×100%。

1.7 統計學方法

數據分析采用SPSS 19.0 統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ADAM17-shRNA 轉染HT29 人結腸癌細胞情況

轉染效率為90%以上的感染復數（multiplicity of infection,MOI）值為100，體外轉染48h，熒光顯微鏡下觀察，根據熒光強度和熒光數判斷轉染情況，可見轉染效率90%以上。見圖1。

2.2 轉染細胞后ADAM17 的表達情況

空白對照組mRNA 表達量分析系統設定恒定為1，轉染組相對表達量為（0.104±0.013），無意義序列組為（1.003±0.036），經方差分析，差異有統計學意義（F=1649.515，P=0.000），轉染組ADAM17 mRNA 的表達被抑制且低于空白對照組和無意義序列組（P＜0.05）?？瞻讓φ战M和無意義序列組ADAM17 mRNA 表達差異無統計學意義（P＞0.05）。Western blotting 結果同樣證實慢病毒轉染后ADAM17 表達被抑制。見圖2。

2.3 單層細胞劃痕損傷修復情況

24 h 后，空白對照組（0.646±0.022）、無意義序列組（0.671±0.027）和轉染組（0.986±0.032）的劃痕間距相對比，經方差分析，差異有統計學意義（F= 10.176，P=0.012），沉默ADAM17 后HT29 細胞的遷移速度均慢于空白對照組和無意義序列組的細胞（P＜0.05），空白對照組和無意義序列組的細胞遷移能力差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖3。

2.4 轉染ADAM17 后細胞體外侵襲能力變化情況

空白對照組和無意義序列組可觀察到穿過Matrigel 膠到達下室的腫瘤細胞多于轉染組。各組的侵襲細胞數分別為（151.004±5.025）、（147.113± 6.333）及（52.002±5.196）個/視野。經方差分析，差異有統計學意義（F=136.936，P=0.000），與空白對照組比較，無意義序列組到達下室的細胞數量差異無統計學意義（P＞0.05）。但與空白對照組和無意義序列組比較，轉染組細胞到達下室的HT29 人結腸癌細胞數量減少很多，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖4。

圖1 ADAM17 慢病毒轉染HT29 人結腸癌細胞48 h 后的轉染情況 （×200）

圖2 轉染后各組ADAM17 mRNA 及ADAM17 蛋白表達情況

圖3 沉默ADAM17 后HT29 人結腸癌細胞遷移能力變化情況 （×100）

圖4 沉默ADAM17 后HT29 人結腸癌細胞侵襲能力變化情況 （×100）

2.5 沉默ADAM17 后MMP-9，ERK 表達情況

沉默ADAM17 蛋白表達后，空白對照組、無意義序列組、轉染組MMP-9 的表達分別為（0.903± 0.104）、（0.878±0.121）及（0.151±0.102），經方差分析，差異有統計學意義（F=47.172，P=0.000），進一步檢測ERK1/2 通路，結果顯示，p-ERK1/2 表達同樣發生下調，空白對照組、無意義序列組、轉染組p-ERK1/2 的表達分別為（0.656±0.141）、（0.647± 0.133）和（0.333±0.102），經方差分析，差異有統計學意義（F=6.130，P=0.035）。沉默ADAM17 后，轉染組MMP9 和p-ERK1/2 的表達均低于空白對照組和無意義序列組（P＜0.05），空白對照組和無意義序列組的MMP9 和p-ERK1/2 的表達差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖5。

圖5 沉默ADAM17 后MMP-9 和ERK1/2 蛋白的表達

3 討論

結腸癌是一種由遺傳、飲食、環境、習慣等多因素共同作用的腸道惡性腫瘤[6]，近年來，由于飲食結構的改變，膳食纖維等攝入減少，結腸癌在我國的發病率也呈逐年上升趨勢[1]。由于缺乏相關預防保健知識，我國大多數結腸癌患者在發現時已處于疾病中晚期。目前，對結腸癌的治療依然是以手術切除為主，輔以同步放化療及靶向治療和生物治療。但是人們現在的目光越來越集中在基于特定基因或功能蛋白的靶向治療上[7]。

ADAM17 是一種具有蛋白水解，活化配體，釋放生物活性因子功能的前體蛋白[8]。研究報道指出，ADAM17 在胃癌，乳腺癌等多種惡性腫瘤中呈異常高表達狀態[5，9]。同樣，也有報道指出，ADAM17 在結腸癌組織中也呈異常高表達狀態，并且，這種高表達狀態與患者出現腫瘤轉移，復發及預后密切相關[10-11]。有研究報道指出，ADAM17 可以通過激活EGFR/MEK/ERK 通路調控細胞生物學行為[12]。

不斷發生的遠處轉移和局部組織侵襲是腫瘤惡性病因的原因之一，也是腫瘤患者治療失敗甚至死亡的原因之一。因此，阻止腫瘤的遠處復發轉移和局部繼續浸潤是目前許多腫瘤藥物的研究重點。腫瘤細胞的遷移侵襲能力的前提條件是對細胞外基質的降解，MMP-9 被證實在多種惡性腫瘤中呈高表達狀態，與患者預后呈負相關[13]。并且MMP-9 的高表達與腫瘤細胞的遷移和侵襲能力呈正相關[14-15]。MMP-9 可以通過降解細胞外基質使細胞穿透[16]。同時，MMP-9 的活化依賴于ERK 信號通路的激活[17]。在本實驗中，在沉默ADAM17 的表達后，MMP-9 的表達被下調，說明沉默ADAM17 可以通過下調MMP-9 的表達，從而影響HT29 人結腸癌細胞的遷移侵襲能力。

ERK 是決定細胞命運的關鍵基因，包括ERK1 和ERK2，在受激活磷酸化后，可以調節細胞的代謝和功能，并產生相應的生物學效應[18]。p-ERK1/2 可以作用于多種細胞內因子最終促使癌基因的表達。各種外界的不同刺激以及不同強度的刺激都可以促使ERK1/2 不同程度的激活，在細胞遷移和黏附中發揮重要作用，從而增強細胞的運動和黏附能力[19]，促使細胞在細胞外基質中移動[20-21]。在本實驗中，進一步檢測ERK 信號通路發現，沉默ADAM17 后，p-ERK1/2的表達被下調，說明沉默ADAM17 可以降低ERK1/2信號通路的激活。

本研究結果顯示，ADAM17 能夠通過ERK 信號轉導通路調控MMP-9 的表達，進而影響細胞的遷移侵襲能力，實現對HT29 人結腸癌細胞增殖遷移侵襲調控的作用，但ERK 通路可能不是其調控腫瘤細胞遷移侵襲的唯一信號通路，其對細胞行為功能的響和具體作用機制需后續實驗進一步探究。