急性髓細胞白血病患者CD96 和CD123 的表達及對預后的意義*

鐘敏，蘇群豪，胡敏，徐璐，陶石

（海南醫學院第一附屬醫院 血液內科，海南 海口 570102）

白血病是由造血干/祖細胞分化、凋亡失調和惡 性增殖引起的一組異質性造血系統惡性腫瘤。大量研究表明，血液中有微量的細胞群，僅占白血病細胞的0.1%～1.0%，稱為白血病干細胞[1]。這些細胞通常會導致白血病復發，對化療藥物敏感性降低，耐藥性增加。急性髓細胞白血病（acute myelocytic leukemia,AML）是一種起源于髓系造血干/祖細胞的惡性腫瘤。臨床表現包括貧血、出血、感染、發熱、臟器浸潤和代謝異常。大多數病例表現為急性和重度狀態，預后較差。白血病干細胞的免疫表型在不同類型的白血病和個體間有差異，與臨床特征、治療反應、生存和預后有關[2]。作為免疫球蛋白超家族的成員，CD96 在大多數CD34+CD38+的AML 干細胞上表達。據報道，CD96 的表達與白血病干細胞的功能有關[3]。新近研究證實在不同的人AML 細胞移植小鼠模型中，所有的未成熟AML 亞群細胞中的白血病干細胞表達IL-3受體α 鏈（CD123）[4]。目前，AML 中白血病干細胞相關抗原CD123、CD96 表達與預后的關系尚不清楚。本研究探討AML 中白血病干細胞相關抗原CD123、CD96 與療效、預后的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2011年1月—2013年6月海南醫學院第一附屬醫院血液內科住院治療的156 例AML 患者為研究對象。其中，男性86 例，女性70 例；年齡15 ～ 49 歲，平均（38.2±10.5）歲。所有患者診斷符合2016年WHO 修訂版造血和淋巴組織腫瘤分類診斷標準[5]。FAB 分類：M1 27 例，M2 35 例，M3 25 例，M4 40 例，M5 29 例。選取同期在本院健康體檢者150 例作為對照組。其中，男79 例，女71 例；年齡18 ～56 歲，平均（46.5±20.1）歲。所有患者都知情同意，并獲得醫院倫理委員會批準。

治療方案及療效標準：AML 患者除急性早幼粒細胞白血病（acute promyelocytic leukemia,APL）外采用三尖杉酯堿（HA）誘導治療2 ～3mg/d，5 ～7 d 或米托蒽醌（NA）10mg/d，3 d，其次是阿糖胞苷150 ～ 300mg/d，鞏固5 ～7 d。APL 患者主要用亞砷酸鈉誘導，或亞砷酸和視黃酸雙重誘導治療。除化療外，所有患者均給予輸血、抗感染與綜合支持治療。療效評價基于血液病診斷和規范治療準則：①完全緩解（CR）：無貧血、出血、感染或白血病細胞浸潤性表現；血紅蛋白＞90g/L，白細胞正常或減少，無未成熟細胞，血小板＞100×109/L；原始細胞和早期細胞骨髓中的嬰兒期細胞（或未成熟細胞）＜5%，正常紅細胞和巨核系。②部分緩解（PR）：臨床、血液和骨的3 個方面中的1 個或2 個方面骨髓不符合CR 標準；骨髓原始細胞和早期幼稚細胞＜20%。③無緩解（NR）：臨床、血液和骨髓方面未能滿足CR 骨髓中的原始細胞和早期幼稚細胞＞20%，包括無效患者。

所有患者隨訪5年，方式為電話或門診，記錄生存時間、化療后感染、化療后復發、髓外浸潤等情況。

1.2 免疫分型檢測

采用乙二胺四乙酸（EDTA）提取骨髓2 ～5ml。化療前采用密度梯度離心法分離骨髓，用淋巴細胞分離液（Ficoll）分離單個核細胞。分別使用4 種顏色熒光標記的FITC-CD34、PE-CD38、PACP-CD123 及APC-CD96 抗體（購自美國BD 公司）檢測細胞。室溫避光孵育10 min。1 000 r/min 離心5 min，棄上清液，最后加入磷酸鹽緩沖溶液（PBS）300 μl 混勻懸浮細胞，用流式細胞儀檢測分析CD123、CD96 表達。FSC/SSC 排除碎片，SSC/CD45 作為空白對照，CD34+CD38-為造血干細胞。此外，CD123+是設置CD34+CD38-造血干細胞鑒定白血病干細胞。若是超過陰性對照20%就確定為抗原表達陽性。

1.3 統計學方法

數據處理采用SPSS 18 統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗；計數資料以例（%）表示，比較采用χ2檢驗；Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，比較采用Log-rank-χ2檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CD96、CD123 在AML 患者中的表達

AML 患者CD96 陽性表達率為（12.85±9.04）%，CD123 陽性表達率為（41.24±10.42）%；對照組：CD96 陽性表達率為（0.26±0.06）%，CD123 陽性表達率為（0.73±0.21）%；AML 患者的CD96 與CD123 陽性表達率與對照組比較，差異有統計學意義（t=12.300 和34.328，均P=0.000）。見圖1。

2.2 AML 患者中CD96、CD123 表達與臨床療效的關系

AML 患者中CD96、CD123 陽性表達的緩解率低于CD96、CD123 陰性表達者，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.3 AML 患者CD96、CD123 表達與預后的關系

圖1 AML 患者中CD96、CD123 的表達情況

表1 CD96、CD123 表達與臨床療效的關系 例

AML 患者中CD96、CD123 陽性表達的生存率低于CD96、CD123 陰性表達者，差異有統計學意義（P＜0.05）；AML 患者中CD96、CD123 陽性表達的化療后感染、化療后復發發生率高于CD96、CD123 陰性表達者，差異有統計學意義（P＜0.05）；AML 患者中CD96、CD123 陽性表達的髓外浸潤發生率高于CD96、CD123 陰性表達者，但差異無統計學意義（P＜0.05）。見表2、3。

表2 AML 患者CD96 表達與預后的關系 [n =78，例（%）]

表3 AML患者CD123表達與預后的關系 [n =78，例（%）]

AML 患者中CD96 陽性表達與陰性表達患者中位生存期分別為（29.33±6.12）和（36.07±8.53）個月，差異有統計學意義（t=5.670，P=0.000）。AML 患者中CD123 陽性表達與陰性表達患者中位生存期分別為（30.51±10.01）和（35.77±8.91）個月，差異有統計學意義（t=3.467，P=0.001）。見圖2。

圖2 CD96、CD123 不同表達患者生存率比較

3 討論

多項研究表明，AML 的發病與白血病干細胞密切相關[6]。白血病干細胞是一群具有自我更新能力的細胞群，可產生異質性白血病細胞群，在白血病細胞增殖、存活、轉移和復發中起重要作用。針對靶向白血病干細胞的多種生物治療方法，如CD33 單克隆抗體、CD44 單克隆抗體和IL-3 細胞因子偶聯細胞毒素，取得良好的臨床效果。白血病干細胞是由正常造血干細胞基因突變在發育過程中產生，因此具有與正常造血干細胞相同的表型，如CD34+CD38-、HLA-DR 和CD71。然而也有不同的表型與造血干細胞，如CD117和CD90。因此，檢測白血病細胞表面特異性抗原標志物，預測疾病治療反應及預后更具有重要的臨床意義。

CD123 是IL-3 受體的α 亞基，在成人正常骨髓單核細胞中所占比例很低（0.1%～0.6%）[7]。相反，CD123 被發現在CD34-細胞的陽性率為2%。CD123廣泛表達在大多數AML 原始細胞及白血病干細胞表面，且與AML 不良預后相關。有研究發現超過45%的AML 患者白血病細胞高表達CD123，且與AML 預后密切相關[8]。國外研究表明，CD34+CD38-CD123+細胞可誘導和維持白血病細胞，提示該組細胞具有白血病干細胞特征，CD34+CD38-CD123+可作為白血病干細胞的表面標志物[9]。

CD96 是免疫球蛋白超家族 CD226 亞家族的組成部分之一，已報道在T 和NK 細胞中表達，但在B 細胞、粒細胞、單核細胞或紅細胞中不表達[10]。有報道稱CD96 在AML 中表達率為30%，不受疾病亞型的影響[11]。有臨床研究發現，AML 患者高表達CD96，且CD96 陽性表達患者緩解率更低，復發率高[12]。另外研究發現[13]，AML 患者CD96、CD123 表達率高于ALL 患者，且兩者化療緩解率差異有統計學意義，提示CD96 與AML 的耐藥有關。

本研究結果發現，41.2%、12.8%的AML 患者白血病干細胞表達CD123、CD96，分別高于對照組患者。療效分析顯示CD123、CD96 陽性表達AML 患者的緩解率低于CD123、CD96 陰性表達患者，生存分析發現CD123、CD96 陽性表達AML 患者的化療后感染、化療后復發發生率更高，中位生存期更短。提示白血病干細胞高表達CD123、CD96 的AML 患者預后更差，為臨床判斷AML 患者預后及指導治療決策提供簡便易行的評估手段。

綜上所述，通過對CD123、CD96 表達的檢測可用于評價AML 患者化療療效及生存預后，分辨出耐藥性高的患者，以便早期干預。同時，靶向CD123、CD96 的細胞免疫治療成為今后研究的方向。不過還有待于大量的實驗來驗證，觀察不同亞型患者CD96、CD123 表達情況及預后，這也是今后研究的方向之一。