RKIP、P27 表達與鼻咽癌發生、發展的關系*

龔永謙，羅興谷，唐洪波

（南華大學附屬第一醫院 耳鼻咽喉科，湖南 衡陽 421001）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）是中國南方及東南亞地區最常見的惡性腫瘤之一，是指發生在鼻咽腔頂部與側壁的惡性腫瘤[1]。鼻咽癌的發病因素還不明確，除了遺傳等因素外，還與環境、生活習慣等因素息息相關。Raf 激酶抑制蛋白（Raf kinase inhibitor protein,RKIP）屬于磷脂酰乙醇胺結合蛋白的一種，是NF-κB 信號通路的內源性抑制子。近來研究發現[2]，RKIP 在NPC 組織中明顯下調。P27 蛋白是一種細胞周期蛋白激酶抑制蛋白，可參與細胞周期調控[3]。研究顯示，P27 蛋白表達水平與腫瘤的發生、發展、預后密切相關[4]。本研究探討RKIP、P27 蛋白在鼻咽癌組織中的表達及與鼻咽癌發生、發展的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年3月—2016年1月南華大學附屬第一醫院病理科收集的鼻咽癌黏膜組織76 例（病例組）和正常鼻咽組織30 例（對照組）。病例組：男性49 例，女性27 例；年齡42 ～78 歲，平均（59.3±11.5）歲；臨床分期：Ⅰ期鼻咽癌患者12 例、Ⅱ期鼻咽癌患者20 例、Ⅲ期鼻咽癌患者30 例、Ⅳ期鼻咽癌患者14 例；經檢查出現淋巴結轉移50 例患者。對照組：男性23例，女性7 例；年齡44 ～75 歲，平均（57.0±12.0）歲。 兩組的年齡、性別差異無統計學意義，具有可比性（P＞ 0.05）。

1.2 納入及排除標準

1.2.1 納入標準 ①鼻咽癌的診斷標準依據病理學結果；②患者年齡＜80 歲；③鼻咽癌組織在獲取標本前，患者無放化療病史；④正常鼻咽黏膜組織來源于因其他外科手術獲取的患者；⑤本研究獲得醫學倫理委員會的批準。

1.2.2 排除標準 ①轉移性鼻咽癌；②既往具有放化療病史；③患者臨床數據、基礎資料不完整。

1.3 免疫組織化學染色

采用免疫組織化學染色法檢測兩組標本中RKIP、P27 蛋白的表達，將切片進行二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化處理，使用SP 法檢測RKIP 的表達，使用3%過氧化氫封閉內源性過氧化物酶15 min，3%牛血清清蛋白封閉1 h 處理，然后分別滴加1 ∶100 山羊抗人RKIP多抗和鼠抗人P27 單克隆抗體（美國Santa Cruz 公司），4℃過夜。沖洗后滴加生物素標記的驢抗兔IgG 工作液（武漢艾美捷科技有限公司），室溫孵育1 h，滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液，孵育1 h。DAB 顯色處理，蘇木精復染，脫色后顯微鏡下觀察。設計空白對照，以PBS 代替一抗，其他操作步驟相同。

1.4 免疫組織化學染色判斷標準

細 胞 質、細 胞 膜 中 定 位RKIP、P27 蛋 白的陽性表達，陽性表達均表現為黃色甚至棕黃色，按照染色強度劃分：無色（0 分）、淡黃色（1 分）、棕 黃 色（2 分）、褐 色 或 者 黑色（3分）；按照染色陽性的細胞比例劃分：≤10% （1 分）、11%～50%（2 分）、51%～75%（3 分）、＞75% （4 分）；染色強度評分與陽性細胞比例評分之積＜3 分判斷為陰性、≥3 分判斷為陽性。染色強度評分與陽性細胞比例評分之積＜3 分（-）；染色強度評分與陽性細胞比例評分之積3 ～5 分（+）；染色強度評分與陽性細胞比例評分之積6 ～9 分（++）；染色強度評分與陽性細胞比例評分之積＞9 分（+++）。

1.5 統計學方法

數據分析采用SPSS 16.0 統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料采用率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組RKIP、P27 蛋白的表達率比較

兩組RKIP 蛋白和P27 蛋白陽性表達率比較，差異有統計學意義（P＜0.05），病例組的RKIP 蛋白陽性表達率低于對照組，病例組的P27 蛋白陽性表達率高于對照組（見表1、2）。RKIP 蛋白在正常鼻咽組織中呈陽性表達，在鼻咽癌組織中呈陰性表達；P27 蛋白在正常鼻咽組織中呈陰性表達，在鼻咽癌組織中呈陽性表達（見圖1、2）。

表1 兩組RKIP 蛋白的表達率比較

表2 兩組P27 蛋白的表達率比較

圖1 RKIP 蛋白的表達 （SP×400）

圖2 P27 蛋白的表達 （SP×400）

2.2 兩組RKIP、P27 蛋白的表達與臨床病理學特征的關系

發生遠處轉移的鼻咽癌患者、Ⅲ期和Ⅳ期鼻咽癌患者、發生淋巴結轉移的鼻咽癌患者病灶組織中的RKIP 蛋白陽性表達率低于未發生遠處轉移的鼻咽癌患者、Ⅰ期和Ⅱ期鼻咽癌患者、未發生淋巴結轉移的鼻咽癌患者，差異有統計學意義（P＜0.05）；RKIP 蛋白陽性表達與患者年齡、性別、T 分級無關（P＞0.05）。見表3。

發生遠處轉移的鼻咽癌患者、Ⅲ期和Ⅳ期鼻咽癌患者、發生淋巴結轉移的鼻咽癌患者病灶組織中的P27 蛋白陽性表達率高于未發生遠處轉移的鼻咽癌患者、Ⅰ期和Ⅱ期鼻咽癌患者、未發生淋巴結轉移的鼻咽癌患者，差異有統計學意義（P＜0.05）；P27 蛋白陽性表達與患者年齡、性別、T 分級無關（P＞0.05）。見表4。

表3 患者臨床病理學特征與鼻咽癌組織中RKIP 蛋白 表達的關系 例（%）

表4 患者臨床病理學特征與鼻咽癌組織中 P27 蛋白表達的關系

續表4

3 討論

NPC 是指起源于鼻咽黏膜上皮和腺體的惡性腫瘤。世界衛生組織調查報道，全球有80%的鼻咽癌患者在中國[5]。近年來鼻咽癌在我國的發病趨勢逐漸上升。隨著鼻咽癌診斷、治療水平的不斷提高，中晚期鼻咽癌的療效得到提高，但是患者的5年生存率仍然為70%[6]。針對細胞信號途徑的分子靶向藥物開創了腫瘤治療的新時代，探索有效的腫瘤診治靶點具有重要意義。

研究鼻咽癌相關基因是揭示鼻咽癌發生、發展機制的重要基礎。RKIP 是一種轉移抑制基因，作為調控多種信號轉導通路的中心蛋白，參與G 蛋白偶聯受體和NF-κB 等信號傳導通路的調節[7]。RKIP 是NF-κB 信號通路的內源性抑制子，通過抑制IκB 激酶的活化來發揮NF-κB 信號通路負性調節的作用。侵襲、轉移是鼻咽癌的主要生物學特征，也是影響患者預后的最重要的原因。研究顯示[8-9]，RKIP 具有促進凋亡，抑制細胞生長和腫瘤轉移的重要功能。研究發現[10]，RKIP 在多種癌癥例如前列腺癌、肝癌、胃癌等多種腫瘤組織中表達下調。然而，RKIP 在NPC侵襲轉移中的作用及其機制仍然不清楚。本研究數據表明，病例組的RKIP 蛋白陽性表達率低于對照組；發生遠處轉移的鼻咽癌患者、Ⅲ期和Ⅳ期鼻咽癌患者、發生淋巴結轉移的鼻咽癌患者病灶組織中的RKIP 蛋白陽性表達率低于未發生遠處轉移的鼻咽癌患者、Ⅰ期和Ⅱ期鼻咽癌患者、未發生淋巴結轉移的鼻咽癌患者；結果表明RKIP 蛋白在鼻咽癌的侵襲和轉移中起到了重要的促進作用。

細胞周期是生命活動的基本過程，腫瘤細胞的發生、發展與細胞周期密切相關。RKIP 可以加速6-10B細胞越過G0/G1 期。因此筆者猜測，RKIP 通過影響腫瘤細胞的細胞周期發揮促進凋亡，抑制細胞生長和腫瘤轉移的重要功能。P27 蛋白是一種新發現的非特異性的細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子（CKI）。主要功能是作為細胞周期素依賴性蛋白激酶（CDK）抑制因子參與細胞周期調控[11]。目前已有關于P27 蛋白與鼻咽癌臨床參數的研究，但是尚無統一的定論，因此本研究在以往研究的基礎上，探索鼻咽癌組織中RKIP 蛋白低表達與P27 蛋白是否相關。P27 作為抑癌基因的一種，是細胞周期負性調控因子，能抑制各種細胞周期蛋白和激酶的活性[12]。實驗證明，P27 蛋白主要通過抑制Cydin-CDKs 復合物的活性來實現其對細胞周期的調控[13]。一方面P27 蛋白能抑制已被激活的CDK 活性，另一方面P27 蛋白也可以抑制CDK的激活過程，實現抑癌作用。研究顯示[14]，P27 蛋白在多種癌癥例如胃癌、食管癌、結腸癌等多種腫瘤中有抑癌作用。本研究結果顯示，病例組的P27 蛋白陽性表達率高于對照組；發生遠處轉移的鼻咽癌患者、Ⅲ期和Ⅳ期鼻咽癌患者、發生淋巴結轉移的鼻咽癌患者病灶組織中的P27 蛋白陽性表達率高于未發生遠處轉移的鼻咽癌患者、Ⅰ期和Ⅱ期鼻咽癌患者、未發生淋巴結轉移的鼻咽癌患者。結果提示P27 的表達上升預示鼻咽癌腫瘤發生的可能性增加，并可能促進鼻咽癌的進展。P27 蛋白的異常表達可以作為評價鼻咽癌是否轉移的一個指標。

綜上所述，鼻咽癌組織中RKIP 蛋白低表達、P27蛋白高表達，并且與鼻咽癌腫瘤的發生、發展密切相關。深入研究RKIP、P27 蛋白在鼻咽癌細胞侵襲轉移中的作用及其機制，對研發相應的靶向藥物、提高臨床療效及改善鼻咽癌患者預后具有重要的臨床意義。