通過轉錄組測序分析識別糖尿病患者冠狀動脈粥樣硬化的新途徑

陳丁源

（青海省心腦血管病專科醫院 急診科，青海 西寧 810012）

心外膜脂肪組織（epicardial adipose tissus,EAT）是一種內臟脂肪組織，與冠狀動脈和心肌緊密相鄰，可分泌大量脂肪因子。EAT 被認為在冠狀動脈疾病（coronary artery disease,CAD）的發生、發展中發揮作用[1]。EAT 可通過巨噬細胞活化、氧化應激，以及先天性炎癥反應等參與CAD[2]。有研究表明，在脂肪細胞功能異常、內臟肥胖癥以及糖尿病相關的冠狀動脈粥樣硬化間存在相互作用[3-4]。盡管如此，糖尿病對CAD 患者EAT 轉錄組的影響尚未得到很好的闡釋。此外，之前的研究大多使用微陣列技術，而EAT的轉錄組測序（RNA-seq）分析在該研究為首次應用。本 研 究 對8 例CAD 和2 型 糖 尿 病（type 2 diabetes,T2DM）的受試者的EAT 進行RNA-Seq 分析，鑒定有差異表達基因，并通過實驗驗證氧化應激途徑下有差異表達的基因。

1 資料與方法

1.1 樣本收集

選取2015年6月—2016年1月青海省心腦血管病專科醫院8 例接受心胸外科手術（冠狀動脈旁路移植術或心臟瓣膜置換術）CAD 患者。冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（以下簡稱冠心病）患者納入標準[5]：①經冠狀動脈造影檢查確診，符合WHO 制訂的冠心病診斷指標；②血清TC＞5.2 mmol/L 或LDL-C＞3.1 mmol/L； ③按NYHA 心功能分級Ⅱ、Ⅳ級；④常見癥狀有胸悶、胸痛、心悸、乏力等。該8 例CAD 患者根據有無T2DM 將患者分為糖尿病組（D 組，n=5）和非糖尿病組（ND 組，n=3）。T2DM 患者納入標準根據1999年世界衛生組織（WHO）診斷標準[6]：①糖尿病癥狀，空腹血糖≥7.0 mmol/L 或餐后2 h 血糖≥11.1 mmol/L； ②無糖尿病癥狀，空腹血糖≥7.0 mmol/L 或餐后2 h 血糖≥11.1 mmol/L，重復再測1 次，仍達以上值者；③無糖尿病癥狀，空腹血糖≥7.0 mmol/L 或餐后2 h 血糖≥11.1 mmol/L，糖耐量實驗2 h 血糖≥ 11.1 mmol/L 者中，符合任意2 條標準或符合同一標準2 次者診斷為糖尿病。此研究由青海省心腦血管病專科醫院醫學倫理委員會批準，患者知情并簽署知情同意書。本研究收治的T2DM 患者有糖尿病史，目前使用抗糖尿病藥物（口服或注射用藥）且血紅蛋白A1c（HbA1c）≥6%。D 組5 例患者。男性2 例，女性3 例；年齡60 ～75 歲，平均（69.6± 5.81）歲，符合T2DM 條件；ND 組3 例患者。男性2例，女性1 例；年齡51 ～66 歲，平均（58.0±7.55）歲，既往有糖尿病或糖尿病前期病史，糖化血紅蛋白≤ 5.7%且未服用抗糖尿病藥物。心臟病專家根據臨床病史，術前冠狀動脈造影和其他常規檢查確定CAD是否存在。發現60 ～75 歲的6 例患者具有CAD，而51 ～57 歲的2 例患者無CAD。基本資料見表1。對每位受試患者進行術前空腹抽血，檢測其血糖、血紅蛋白A1c（HbA1c）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）和天冬氨酸轉氨酶（AST）。ALT 被當作胰島素抵抗的替代指標[7]。在患者右冠狀動脈近端部分附近獲得EAT樣本，其深度至心包的內臟層。獲得組織樣本儲存于液氮中直至提取RNA 進行測序處理。

1.2 脂肪RNA 提取

對收集的脂肪組織提取RNA。在2 ml TRI 試劑緩沖液中分離大約200 μg 脂肪組織。將樣品在室溫下溫育5 min，并在4℃下12 377 r/min 離心10 min。除去脂肪單層，并將上清液收集到2 個1.5 ml 微量離心管中，每管中加入200 μl 氯仿（CHCl3）。通過渦旋混合后，將樣品在4℃下12 377 r/min 離心30 min。收集上層液相并與200 μl 氯仿混合，然后在4℃、12 377 r/min 離心30 min。然后將富含RNA 的上層相與1.5 倍體積的100%乙醇混合。將混合物裝載到RNeasy 離心柱（德國凱杰公司）中。多次洗滌后，用60 μl H2O 洗脫RNA。使用生物分析儀測量RNA 的質量和數量。所有樣本的RNA 完整性（RIN）都在8 以上。

表1 患者基本信息

續表1

1.3 測序數據處理

本轉錄組測序由上海致禾生物公司實施，將提取的RNA 在HiSeq 2000 儀器進行測序，最終獲得原始測序數據。利用TopHat 軟件，將序列比對到人類參考基因組中。采用百萬外顯子的堿基片段（fragments per kilo bases per million reads,FPKM）評估基因表達水平。應用Cufflinks 對實驗組以及對照組的組織的比對文件進行分析，挖掘出錯誤發現率＜0.05 有差異表達的基因。

1.4 逆轉錄聚合酶鏈反應

根據相同的納入標準，經過數據挖掘后，將后選的基因在擴大樣本量中進行表達驗證，擴大樣本為另外單獨收集的20 對，包括20 個糖尿病患者和20 個非糖尿病患者的EAT 樣本。并按照qScript Flex cDNA試劑盒（美國安諾倫公司）說明書的步驟進行逆轉錄。使用具有10 μl 反應物的Perfe CTA SYBR Green Fast Mix ROX（美國安諾倫公司）在ABI 7900（美國生命技術科技公司）進行RT-PCR。使用ABI 7900 HT 軟件分析轉錄物擴增結果，并且使用2-ΔΔCt方法將所有值歸一化為SDHA 的水平。

1.5 基因富集分析

使用EnrichR[8]對識別的差異表達基因進行富集分析。具體分析類型有基因本體論（GO）富集，信號通路（KEGG）分析。

1.6 Western blotting 檢測FRA1 和PTX2 表達

BCA 蛋白定量試劑盒、Western 制膠試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司。BCA 法測蛋白質濃度，取50 μg 蛋白質用10%的分離膠和濃縮膠進行電泳分離，電轉移至PVDF 膜。5%脫脂牛奶室溫搖床封閉1 h，孵育1 ∶2 000 比例FRA1 和PTX3 一抗4℃搖床過夜。次日，回收一抗，1×TBST 洗膜8 min/次，3 次，室溫孵育1 ∶5 000 比例二抗1 h，再次用1×TBST 洗膜8 min/次，3 次，ECL 發光試劑曝光。

1.7 統計學方法

數據分析采用R 語言2.39 軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 D 與ND 組患者EAT 的RNA-seq 分析

通過D 組與ND 組EAT 的RNA-Seq 數據識別到592 個差異表達基因，其中433 個基因在糖尿病EAT中表現為上調，159 個基因表現為下調。見圖1。

2.2 D 組EAT 中上調的基因

圖1 ND 組和N 組差異表達基因聚類圖

在D 組EAT 中高表達基因是ARC（Fold Change,FC=80），與調控細胞骨架相關蛋白有關。根據差異表達的分析結果，11 個高表達基因其參與的功能作用各不相同（見表2）。隨后，將識別到的所有上調基因進行富集分析，挖掘其潛在的功能，結果顯示D組EAT 中上調的基因與炎癥反應密切相關，包括炎癥反應途徑、細胞因子產生及白細胞遷移途徑。KEGG通路分析進一步證實，上調基因主要參與炎癥相關通路，如cytokine-cytokine 相互作用、TNF、NF-κB，JAK-STAT。值得注意的是，在D 組EAT 中發現有20 個上調基因富集于AGE-RAGE 信號途徑，該途徑的重要配體包括S100A8 和S100A9，其FC 分別為4.79 和4.90。此外，本研究結果識別26 個脂肪因子和脂肪因子受體（如TNF 家族成員TNFRSF12A、TNFRSF13C 和趨化因子受體CXCR1 和CXCR2 等）在D 組EAT 中表現為高表達（見表3）。大部分脂肪因子如CSF3、IL-1β、IL-6 及CCL2 均表現為促炎性。使用qRT-PCR 進一步驗證由RNA-Seq 識別一些具有差異表達的基因，該基因包括CSF3、EMP1、FOSL1、GOS2、IL-6、MT2A和THSB1。qRT-PCR 的結果證實該基因在D 組EAT 中為高表達。見圖2。

2.3 D 組EAT 中下調的基因

在D 組EAT 中下調的基因包括KRT19、RSP01、PTX3、KLK11 和DNAJC22等。該基因可能參與CAD和糖尿病性心臟病的發生、發展。

2.4 在D 組EAT 中氧化應激標志物的應用

為探究EAT 中的RNA 表達變化是否由高血糖引起的氧化應激增加所致，本研究分析以前研究報道過的在氧化應激作用下表達有改變的基因。結果發現，15 個基因在D 組和ND 組的EAT 中均有表達，且其 中8 個 基 因（FRA1、PTX3、CDKN1A、GDF15、TIRAPP、RGS16、PLK3 和ETS2）的差異有統計學意義。

2.5 蛋白表達

根據基因表達的FDR 顯著性，選擇與氧化應激途徑有關并且有差異表達的2 個基因（FRA1和PTX3）（見圖3），通過免疫印跡在EAT 中證實相關基因編碼蛋白的表達情況。結果表明，在另外的20對D 組 和ND 組的EAT 中FRA1（FOSL1 蛋 白）的Western blotting 結果為增加；PTX3 的Western blotting結果為降低（見圖4）。該蛋白表達結果與RNA-Seq結果一致。

表2 各基因的表達變化 （±s）

表2 各基因的表達變化 （±s）

基因名稱 參與的功能表達量 兩組基因表達值的倍數變化 t 值 P 值ND 組 D 組ARC 骨架信號 0.291±0.002 25.242±3.021 87.312±23.123 34.211 0.000 LINC01348 未富集 0.262±0.001 15.991±2.232 60.711±18.342 45.212 0.000 LIPG 脂蛋白代謝 0.263±0.002 10.591±7.521 40.573±14.231 23.233 0.000 PTX3 免疫信號 2.562±0.013 97.712±14.321 38.231±13.234 24.232 0.000 CSF3 免疫信號 1.053±0.023 28.171±5.342 26.792±12.123 24.112 0.000 LBP 免疫信號 1.362±0.021 35.241±6.342 25.884±13.245 23.783 0.000 FOSL1 細胞增殖 1.562±0.032 37.191±6.311 23.912±13.245 22.324 0.000 SLC7A5 新陳代謝 1.212±0.012 22.432±8.234 18.543±9.234 21.231 0.000 MMP-19 細胞外基質重塑 8.923±2.043 162.072±34.321 18.171±9.073 20.123 0.000 SLC16A10 營養運輸 0.682±0.022 11.251±3.211 16.472±8.421 18.231 0.000 TNFRSF12A 內皮細胞 6.253±2.021 100.471±23.251 16.083±7.782 17.234 0.000

表3 各脂肪因子及其受體的差異表達 （±s）

表3 各脂肪因子及其受體的差異表達 （±s）

基因名稱 參與的功能表達量 兩組基因表達 值的倍數變化 t 值 P 值ND 組 D 組CSF3 免疫信號 1.051±0.021 28.172±9.241 26.792±13.123 20.123 0.000 LBP 免疫信號 1.361±0.021 35.241±13.244 25.882±12.345 21.244 0.000 CXCL8 免疫信號 6.471±1.213 104.112±23.133 16.112±9.282 18.342 0.000 IL1RN 免疫信號 1.481±0.011 21.623±5.213 14.592±8.081 16.231 0.000 INHBA 免疫信號 0.711±0.002 11.332±2.234 15.982±7.625 15.232 0.000 IL-6 免疫信號 25.811±5.114 301.742±33.123 11.692±6.861 13.232 0.000 FGF9 免疫信號 3.432±0.123 0.453±0.002 0.132±0.023 3.234 0.000 LIF 免疫信號 4.692±0.421 69.062±23.12 12.593±5.982 11.234 0.000 STC1 免疫信號 3.292±0.231 35.423±7.234 10.772±5.982 10.232 0.000 PROK2 免疫信號 0.792±0.001 7.512±2.121 9.532±5.091 8.232 0.000 CXCL3 免疫信號 1.432±0.012 17.282±6.234 12.131±6.012 9.234 0.000 OSM 免疫信號 2.092±0.012 17.682±5.829 8.483±5.051 8.234 0.000 OPN 免疫信號 6.522±1.231 60.762±20.231 9.722±4.811 8.234 0.000 CHI3L1 免疫信號 5.751±1.012 42.921±13.232 7.462±4.013 7.231 0.000 IL-1β 免疫信號 4.141±0.781 30.123±10.234 7.283±3.872 6.232 0.000 CCL2 免疫信號 85.812±18.122 671.532±78.231 7.832±3.641 6.231 0.000 AREG 免疫信號 4.321±0.781 31.741±10.232 7.392±3.342 5.811 0.000 TNC 免疫信號 7.292±1.231 43.812±15.232 6.012±3.021 5.552 0.000 CXCL2 免疫信號 26.253±8.213 152.232±34.234 5.821±2.671 5.134 0.000 PLAU 免疫信號 9.813±1.245 53.182±16.232 5.422±2.512 5.012 0.000 SEMA4A 免疫信號 18.935±6.431 94.612±20.121 5.012±2.341 4.812 0.000 ALPL 免疫信號 6.462±2.123 32.672±15.231 5.053±2.221 4.712 0.000 CCL19 免疫信號 18.161±6.123 79.332±17.231 4.373±2.123 4.521 0.000 SEMA7A 免疫信號 1.152±0.123 5.212±1.263 4.552±2.412 4.411 0.000 BMP-4 免疫信號 15.792±6.331 4.633±1.234 0.293±0.003 2.123 0.000 VEGFA 免疫信號 31.112±9.123 112.711±34.234 3.623±1.341 4.012 0.000 SEMA6B 免疫信號 6.273±1.248 22.132±6.21 3.534±1.347 3.712 0.000 ECGF1 免疫信號 24.892±9.193 77.943±23.112 3.133±1.623 3.012 0.000 FSTL3 免疫信號 21.543±9.124 48.943±32.344 2.274±1.221 2.813 0.000 SLIT2 免疫信號 18.262±6.731 10.142±2.124 0.563±0.032 1.123 0.000

圖2 qRT-PCR 驗證基因表達結果 （±s）

圖3 FRA1 和PTX3 凝膠圖像處理系統定量檢測結果 （±s）

3 討論

圖4 FRA1 和PTX2 Western blotting 結果

本研究發現，糖尿病EAT 的差異表達基因高度富集于炎癥反應。這支持以前研究的數據，證實EAT 中炎癥反應引起的轉錄組水平差異[9-11]。在糖尿病EAT中上調的基因包括不同的炎癥反應途徑，例如細胞因子產生、白細胞遷移、細胞因子-細胞因子相互作用，以及TNF、NF-κB、JAK-STAT 和AGE-RAGE信號傳導等。值得注意的是，在糖尿病EAT 中，20 個上調基因屬于AGE-RAGE 信號傳導，目前該信號途徑在加速糖尿病患者冠狀動脈粥樣硬化過程中的促炎和促纖維化通路的激活中發揮關鍵作用[12]。RAGE 是結合AGE 和其他炎癥細胞因子的多配體受體。激活的AGE-RAGE 途徑可能引起會糖尿病EAT 患者的局部和慢性炎癥反應。在EAT 中RAGE 的表達增加與炎癥、脂肪細胞肥大、脂聯素降低以及胰島素信號受損相關[13]。有人提出CAD 患者中EAT 代謝紊亂可能與RAGE 過度表達有關[13]。高血糖激活的AGERAGE 途徑可以上調轉錄因子的表達。該轉錄因子的失衡和上調導致許多基因的差異轉錄。在糖尿病EAT中顯著上調的轉錄因子為NF-κB 家族和FOS 家族成員。值得注意的是，本研究發現，NF-κB 途徑中的14 個基因在糖尿病EAT 中表現為上調，表明NF-κB信號通路在糖尿病EAT 中被激活。糖尿病中的AGERAGE 通路可首先激活NF-κB 信號。因此，NF-κB家族轉錄因子可進一步調節EAT 中靶向基因的表達。總之，本研究發現，NF-κB 信號的激活可能是引起糖尿病EAT 中基因表達變化的原因，從而進一步促進CAD 的發病。

促炎脂肪因子TNF、ILs 和趨化因子受體（如CXCR1 和CXCR2）在糖尿病EAT 中表現為高表達，這與以前的研究結果一致[2，14]。心外膜炎癥分子的旁分泌可能引起代謝和炎癥環境的改變從而促進動脈粥樣硬化形成。細胞增殖和斑塊形成增加了動脈壁厚度，動脈粥樣硬化形成過程中使旁分泌擴散更困難。本研究結果表明許多基因在糖尿病EAT 的炎癥反應中被激活。

糖尿病EAT 的轉錄組變化可能與高血糖引起的氧化應激有關。本研究發現，FRA1、PTX3、CDKN1A、GDF15、TIRAPP、RGS16、PLK3和ETS2的 差 異 表達表明氧化應激對糖尿病EAT 樣本的影響。特別是CDKN1A 和GDF15 是p53 信號通路的成員，該信號通路先前已被證明與氧化應激和心血管疾病有關[15]。后續研究根據是否有差異表達，篩選出2 個基因（FRA1和PTX3）進行實驗驗證，與測序結果一致。

本研究首次發現，在糖尿病EAT 中高度富集的FOSL1 蛋白編碼基因，是一種參與細胞增殖、分化和轉化的調節因子。FOSL1 與Toll 樣受體（TLRs）信號通路有關。該發現可能具有重要意義，因為EAT 內導致動脈粥樣硬化的炎癥過程也可能涉及先天免疫炎癥反應。Toll 樣受體TLR 刺激炎癥介質的轉錄從而引起先天性免疫反應。TLRs 的激活將NF-κB 易位至胞核內，從而啟動IL-1β，IL-6，TNF-α 和抵抗素的轉錄、釋放[16]。

另一個新的糖尿病EAT 下調基因為PTX3，它是先天性和適應性免疫應答的關鍵組成部分。該發現與EAT 在參與動脈粥樣硬化發展和進展的先天性炎癥反應中的作用一致。PTX3 在動脈粥樣硬化中的作用存在爭議，因為最近的觀察表明，PTX3 實際上可能具有心血管保護功能[17]。PTX3 在糖尿病EAT 中的下調可能反映對嚴重CAD 的保護性反應。適應性或者不適應性免疫應答的機制可能導致EAT 心臟保護基因的上調或下調[9]。

本研究存在一些局限性。首先，用于RNA-Seq的樣本數量較少，需要大樣本量來證明結果的可靠性。然而，本研究通過獨立隊列對鑒定的重要基因進行RT-PCR 和Western blotting 的驗證，結果與本研究的RNA-Seq 一致。其次，盡管本研究分析一些脂肪細胞因子參與的分子/細胞功能和信號途徑，但仍可能存在被忽略的其他功能和信號途徑。最后，本研究缺少對鑒定基因的功能驗證。

綜上所述，本研究為T2DM 和CAD 受試者的EAT 轉錄組測序分析提供新的研究方向。糖尿病EAT轉錄組主要富集參與炎癥，免疫應答和內皮損傷的基因。本研究數據顯示，EAT炎癥基因表達可能是由于上調的細胞因子，主要是NF-κB 和FOS 的作用，主要由AGE-RAGE 信號傳導激活。此外，發現糖尿病EAT 的轉錄組變化與高血糖引起的氧化應激關系。本研究的數據結果可能描述糖尿病患者導致冠狀動脈粥樣硬化的新途徑，為理解糖尿病冠心病的病理生理學作用的新假說提供了理論依據。