二甲雙胍對博來霉素誘導大鼠肺纖維化的影響*

簡悅，趙勇，江洪艷，王先梅，伍義蘭，劉洪艷

（1.遵義市第一人民醫院 呼吸科，貴州 遵義 563002；2.遵義醫科大學附屬醫院呼吸一科，貴州 遵義 563000）

特發性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis,IPF）是一種原因不明的慢性進行性肺間質纖維化性疾病，多預后不良。IPF 好發于老年患者，50 歲以下人群罕見，男性發病率高于女性，一般生存期為確診后的2 ～3年，發病率6.8 ～16.3 人/10 萬。在1991 ～2003年間IPF 的發病率每年上升約11%，且IPF 發病率和患病率仍在持續增加[1]，因此尋找IPF 合適的治療方法迫在眉睫。SUN 等[2]發現，二甲雙胍能減少肺纖維化模型小鼠肺泡灌洗液中炎癥細胞數量，同時抑制轉化生長因子β（transforming growth factor- beta,TGF-β）、膠原蛋白的產生，使支氣管周圍膠原沉積減少，從而抑制肺纖維化的發生發展，且本實驗前期已證明二甲雙胍對于早期肺纖維化（7 d）有一定的治療效果，故本實驗探討對中晚期肺纖維化的治療效果。

1 材料與方法

1.1 主要儀器、動物與試劑

電子天平（北京賽多利斯天平有限公司），高壓蒸汽滅菌器（日本TOMY 公司），純水系統（美國Millipore 公司），酶標儀（美國Thermo 公司），手持超聲勻漿機（日本Sanyo 公司），微量可調節移液器、IP Win32 采圖系統DM4000B（德國Eppendorf 公司），Germany 光學顯微鏡NIKON ＆ ys100（德國Leica 公司），冷凍臺式離心機（美國Eppendorf 公司），石蠟包埋機（銀河實驗儀器有限公司），-20℃低溫冰箱、-80℃超低溫冰箱（日本Sanyo 公司），37℃孵箱（美國HIRASMWA 公司）。SD 雄性大鼠44 只，購自第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所實驗動物中心，寄養于遵義醫學院實驗動物中心。

Masson 染色劑、HE 染色劑（北京誠林生物科技有限公司），二甲雙胍片（中美上海施寶制藥有限公司），吡非尼酮（北京康蒂尼藥業有限公司），潑尼松（浙江仙據制藥有限公司），博來霉素（浙江海正輝瑞制藥有限公司），大鼠TGF-β 及HYP 酶聯免疫試劑盒（貴州晟瑞達生物科技有限公司）。

1.2 動物模型的復制及分組

空白對照組（4 只）大鼠氣管注射生理鹽水1 ml/kg。 成功復制模型的24 只大鼠隨機分為4 組，每組6只。模型組、二甲雙胍組、潑尼松組、吡非尼酮組大鼠氣管內單次注入博來霉素5 mg/kg（按5 mg/ml 溶于生理鹽水）復制肺纖維化模型。于模型復制后第15 天起據體重予以每日灌服相應藥物（其中空白對照組和模型組為生理鹽水5 ml/kg，其余各組分別予以：二甲雙胍250 mg/kg、潑尼松5 mg/kg、吡非尼酮50 mg/kg，每間隔24 h 給藥1 次，用藥14 d 后處死大鼠并取材）。

通過ELISA 雙抗體夾心法檢測支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）中TGF-β 的含量及肺組織勻漿液中羥脯氨酸（Hydroxyproline,HYP）的含量。并取肺組織行Masson 染色及HE 染色以觀察大鼠肺組織病理變化。

1.3 標本的收集

BALF 收集及制備：將采血完畢的大鼠，沿前正中線剪開頸部和胸腔，用手術線結扎右主支氣管。然后用組織剪在頸部氣管遠心端處剪開一小口，并插入去掉針芯的留置針軟管，用絲線結扎氣管防止留置針脫落，將3 ml 生理鹽水緩慢注入氣管，然后回抽，反復重復3 次，若收集BALF 占原液的60%以上算合格，將收集的BALF 離心（3 000 r/min，20 min，4℃），收集上清液分裝于EP 管中，置于-80℃冰箱冷凍保存待用。

肺組織采集及勻漿液制備：將結扎的右肺切除，取右肺上葉和/或中葉用生理鹽水沖洗表面血液，然后用濾紙吸干。取出少量肺組織稱取重量，置于9 倍重量的生理鹽水中，用眼科剪剪碎肺組織，后用超聲勻漿機將肺組織充分勻漿（整個過程都需低溫進行），在4℃、3 000 r/min 離心20 min，收集上清液分裝于EP 管中待檢測或存于-80℃冰箱冷凍保存待用。

1.4 肺組織病理檢查

肺組織病理標本的制備：取右肺下葉（若肺組織較小可加采集右肺中葉）并固定于10%多聚甲醛中。由遵義醫學院附屬醫院病理科行HE 染色、Masson 染色（嚴格按說明書執行）。病理結果評分：在光學顯微鏡下觀察HE、Masson 染色病理切片，采取計算機圖像分析軟件IP Win32 采圖系統采集圖片，放大倍數200 倍，并嚴格根據SZAPIEL 等[3]的評分標準，采取雙盲法由2 人評分并取平均數記分，其中肺泡炎癥及肺纖維化程度評分為1 級：0 分，無肺泡炎；2 級：1 分，有輕度肺泡炎和肺纖維化，局部單核細胞浸潤不到全肺20%，肺泡結構無明顯破壞；3 級：2 分，中度肺泡炎和肺纖維化，面積約占全肺的20%～50%；4 級：3 分，重度肺泡炎和肺纖維化。面積≥全肺50%，肺泡腔內偶有單核細胞和/或出血造成實變。

1.5 雙抗體夾心法檢測BALF 中TGF-β 及HyP的含量

①加樣。分別設標準孔、待測樣品孔、空白孔。設標準孔7 孔，依次加入100 μl 不同濃度的標準品?？瞻卓准?00 μl 標準品稀釋液，余孔加待測樣品100 μl，酶標板加上覆膜，37℃溫育1 h。②棄去液體，甩干，不用洗滌；③每孔加檢測溶液A 工作液100 μl（臨用前配制），酶標板覆膜，37℃溫育1 h；④棄去孔內液體，每孔用350 μl 的洗滌液洗滌，浸泡1 ～2 min，在吸水紙上輕拍酶標板來移除孔內所有液體。重復洗板3 次。最后1 次洗滌后，吸取或倒出剩余的洗滌緩沖液，將酶標板倒扣在吸水紙上，將殘留在孔內的液體全部吸干。此過程也可采用噴射瓶，多道移液器或自動洗板機來完成；⑤每孔加檢測溶液B工作液（臨用前配制）100 μl，酶標板覆膜，37℃溫育30 min；⑥棄去孔內液體，甩干，洗板5 次，方法同步驟4；⑦每孔加TMB 底物溶液90 μl，酶標板覆膜，37℃避光顯色（反應時間控制在10 ～20 min，不要超過30 min。當標準孔的前3 或4 孔有明顯的梯度藍色，后3 或4 孔梯度不明顯時，即可終止）；⑧每孔加終止溶液50 μl，終止反應，此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物溶液的加入順序相同。如出現顏色不勻一，請輕輕晃動酶標板以使溶液混合均勻；⑨在確保酶標板底無水滴及孔內無氣泡后，立即用酶標儀在450 nm 波長測量各孔的光密度（OD）值；⑩HYP的檢測方法與TGF-β相同，具體操作步驟如上。

1.6 統計學方法

數據分析采用SPSS 20.0 統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，用Prism 5 軟件繪圖，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠模型復制及用藥后死亡情況

空白對照組于灌服生理鹽水后第13 天死亡1 只，其余大鼠予以博來霉素模型復制后14 d 內間斷出現死亡，死亡的大鼠主要集中在模型復制后前5 d 15 只。各組大鼠在予以相應藥物干預期間，除模型組及潑尼松組各死亡1 只外，其余各組均無大鼠死亡。見圖1、2。

圖1 空白對照組與模型復制后大鼠存活率

圖2 各組大鼠用藥干預期間存活率

2.2 各組大鼠肺組織病理特征

光鏡下肺組織肺泡炎癥及肺纖維化程度及病理評分：空白對照組（0.250±0.289）分，模型組（2.000± 0.707）分，二甲雙胍組（0.917±0.548）分，潑尼松組（1.600±0.5478）分，吡非尼酮組（1.333±0.516）分，經方差分析，差異有統計學意義（F=8.554，P= 0.000）；模型組高于空白對照組、二甲雙胍組、吡非尼酮組（P＜0.05），潑尼松組高于二甲雙胍組（P＜0.05）。

空白對照組：光學顯微鏡下對照組大鼠肺泡結構清晰，肺泡壁完整且連續，肺泡腔透亮，肺泡間隔偶可見少量炎癥細胞浸潤。模型組：大鼠肺組織肺泡腔內可見大量炎癥滲出，可見單核細胞、淋巴細胞和中性粒細胞等炎癥細胞浸潤，肺泡間隔明顯增寬，可見大量肺實變。二甲雙胍組：大鼠肺組織肺泡結構基本完整，肺泡腔內可見散在炎癥細胞浸潤，肺泡間隔稍有增寬，無明顯實變，肺血管腔內可見充血及炎癥滲出。潑尼松組：大鼠肺組織肺泡腔可見片狀炎癥滲出，肺泡間隔明顯增寬，肺泡間隔及肺泡腔內可見大量炎癥細胞浸潤，肺泡結構破環明顯。吡非尼酮組：大鼠肺組織內可見肺泡結構部分被破壞，肺泡壁稍有增厚，部分肺泡腔及肺泡間隔內可見炎癥細胞浸潤及散在充血。見圖3、4。

圖3 各組大鼠肺組織病理特征 （HE ×200）

圖4 各組大鼠HE 病理評分比較 （±s）

2.3 各組大鼠Masson 染色及肺纖維化評分

空白對照組（0.125±0.250）分，模型組（2.200± 0.447）分，二甲雙胍組（1.333±0.516）分，潑尼松組（1.800±0.447）分，吡非尼酮組（1.168±0.408）分，經方差分析，差異有統計學意義（F=14.372，P=0.000）?？瞻讓φ战M：光鏡下可見大鼠肺組織結構基本完整，肺泡間隔內未見明顯膠原沉積，在支氣管和血管周圍見少量膠原沉積；模型組：肺泡間隔明顯增寬，肺泡間隔內可見大量膠原沉積成片狀、絮狀沉積，肺泡結構破壞，肺泡間隔充血明顯，與空白對照組相比較（P＜0.05）；二甲雙胍組：大鼠肺泡結構基本完整，肺泡間隔內可見散在點狀、絮狀膠原沉積，在終末氣管、支氣管及血管周圍纖維化病灶相對較為明顯，與模型組比較（P＜0.05）；潑尼松組：大鼠肺組織內可見條索狀纖維化病灶，廣泛分布肺組織，其中以支氣管及血管周圍纖維化病灶尤其明顯，肺泡間隔稍有增寬伴膠原沉積明顯，肺泡壁結構破壞，在肺泡間隔內可見充血明顯，與模型組比較，差異無統計學意義（P＞ 0.05）；吡非尼酮組：肺泡結構基本完整，肺泡壁稍有增厚，肺泡間隔內可見散在線性及絮狀纖維化病灶，肺泡間隔及肺泡腔內稍有充血水腫，在支氣管及血管周圍纖維化不明顯，與模型組和潑尼松組比較，差異有統計學意義（均P＜0.05）；但相較于二甲雙胍組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖5、6。

2.4 各組大鼠肺組織中HyP 含量比較

空白對照組（188.211±15.551）μg/ml，模型組 （285.046±17.046）μg/ml，二甲雙胍組（245.996± 10.132）μg/ml，潑尼松組（269.546±13.402）μg/ml，吡非尼酮組（230.238±11.049）μg/ml，經方差分析，差異有統計學意義（F=30.999，P=0.000）。在肺組織勻漿液中模型組HYP 的含量較各組有所增高，除與潑尼松組無差異外（P＞0.05），與其余各組差異有統計學意義（P＜0.05），且二甲雙胍組相較潑尼松組（P＜0.05）；吡非尼酮組較潑尼松組有所降低（P＜0.05）。見圖7。

2.5 各組大鼠BALF 中TGF-β 含量比較

空白對照組（64.799±5.111）pg/ml，模型組（106.553±9.995）pg/ml，二甲雙胍組（85.731± 3.631）pg/ml，潑尼松組（96.751±7.912）pg/ml，吡非尼酮組（80.511±2.748）pg/ml，經方差分析，差異有統計學意義（F=25.333，P=0.000）。在BALF 中模型組TGF-β 的含量較空白對照組有所增高（P＜0.05）；二甲雙胍組較模型組TGF-β 的含量有所降低（P＜0.05）；潑尼松組較模型組TGF-β的含量有所降低（P＜0.05）；吡非尼酮較模型組TGF-β的含量有所降低（P＜0.05）；二甲雙胍組相較潑尼松組有所降低（P＜0.05），但相較于吡非尼酮組較潑尼松組差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖8。

圖5 各組大鼠肺組織結構變化 （Masson ×200）

圖6 各組大鼠肺組織Masson 染色病理評分 （±s）

圖7 各組大鼠肺組織中HyP 含量 （±s）

圖8 各組大鼠BALF 中TGF-β 的含量 （±s）

3 討論

目前許多學者認為，炎癥是特發性肺纖維化早期的主要作用機制之一，但較少參與中晚期特發性肺纖維化的發生、發展。在前期實驗研究中發現，二甲雙胍能夠有效抑制由博來霉素誘導的早期（7 d）肺纖維化，考慮其作用機制可能是二甲雙胍通過抑制TGF-β 的分泌和HYP 的產生，從而達到抑制肺纖維化的作用。為探討二甲雙胍對中晚期肺纖維化是否有療效，且為更加符合臨床干預過程，故選擇在模型復制14 d 后予以相應藥物干預以觀察療效。實驗結果顯示二甲雙胍能夠降低由博來霉素誘導的肺纖維化大鼠死亡率。

通過HE 染色并采用SZAPIEL 等評分標準以了解肺部炎癥變化情況，結果顯示二甲雙胍具有一定的抗炎作用。HE 染色顯示模型組炎癥滲出明顯，而二甲雙胍組炎癥減輕，與此前許多實驗報道二甲雙胍能減輕肺部相關疾病炎癥的結論相一致[4-5]。盡管有學者認為在肺纖維化中晚期炎癥較少參與其中，但本實驗通過HE 染色發現在模型復制28 d 后仍有炎癥細胞浸潤、滲出，且CHEN 等[6]研究也發現，在博來霉素模型復制42 d 后肺組織仍有炎癥表現，故推測在博來霉素誘導的中晚期肺纖維化中炎癥仍參與其中，因此二甲雙胍抗炎作用在緩解大鼠肺纖維化中也有著積極的治療作用。在本實驗中吡非尼酮的抗炎作用可能與CHAN等[7]的研究發現相一致，認為吡非尼酮抑制纖維化的機制可能是通過能調節多種細胞因子相關，其中包括TGF-β、結締組織生長因子、血小板衍生因子和腫瘤壞死因子等。本實驗提示吡非尼酮的抗炎作用較二甲雙胍弱，可能為本實驗中吡非尼酮的劑量為50 mg/kg屬于一個低劑量或是中等劑量，而有研究報道稱吡非尼酮在抗肺纖維化疾病中有藥物濃度依賴性，因此加用劑量可能會有更加積極的治療效果；其次吡非尼酮的吸收部位主要在腸道，本實驗采用去除膠囊的吡非尼酮溶液灌胃，故而會導致藥物破壞增加，吸收減少。有研究發現，靜脈予以吡非尼酮治療效果較口服給藥效果更佳。最后也不排除本實驗結果是由取材部位及灌藥物時誤入氣管等所致。

在模型組病理提示膠原纖維在肺間質呈片狀、團塊狀沉積，提示模型復制成功。二甲雙胍和吡非尼酮能夠減輕由博來霉素誘導的肺纖維化，其中吡非尼酮組治療效果更加明顯，但兩者之間差異并無統計學意義。

眾所周知肺纖維化的病理表現主要為細胞外基質的過度沉積，當肺膠原蛋白合成增加，降解減少時，導致膠原纖維增多，最終使膠原過度沉積。HYP 在膠原蛋白中約占13.4%，是膠原蛋白一種特有的氨基酸，幾乎所有HYP 都存在于膠原中，而膠原是肺纖維化時細胞外基質的主要成分，故HYP 水平能反映肺組織纖維化的嚴重程度[8]。

本實驗中模型組HYP 的含量比空白對照組高，進一步證明模型復制成功。其中二甲雙胍組及吡非尼酮組HYP 的含量比模型組低，提示二甲雙胍及吡非尼酮對博來霉素誘導的肺纖維化是有一定的治療意義，而潑尼松組肺纖維化并未明顯得到改善，與目前大家認為的激素不能改變中晚期IPF 患者的死亡率及預后相一致。

在前期實驗發現二甲雙胍能夠有效抑制由博來霉素誘導的早期肺纖維化，考慮其作用機制可能是二甲雙胍通過抑制TGF-β 的分泌和HYP 的產生，從而達到抑制肺纖維化的作用，且TGF-β 被認為是最為關鍵的致纖維化因子，它在肺的發育過程中是一個負性調控因子。目前認為TGF-β 通過Smad 途徑調節細胞的增殖、分化、遷移、黏附及凋亡等，從而調控肺纖維化的發生、發展[7]。

進一步檢測TGF-β，發現通過博來霉素模型復制后TGF-β 的含量增加，而二甲雙胍組及吡非尼酮組TGF-β 的含量降低，兩者之間差異無統計學意義。有研究發現[10]，二甲雙胍及吡非尼酮通過減少TGF-β 的產生，從而使未成熟成纖維細胞生長受限，抑制了成纖維細胞遷移、增殖，導致成纖維細胞表型轉換為肌成纖維細胞發生障礙，繼而減輕膠原蛋白等細胞外基質在肺間質和肺泡間過度積聚，從而抑制肺纖維化的發生與發展，本實驗中二甲雙胍及吡非尼酮能減少TGF-β的產生，從而考慮其對肺纖維化的發生、發展起著一定的調控作用。

總的來說，二甲雙胍能減少TGF-β 分泌及HYP的產生，對由博來霉素誘導的中晚期肺纖維化是有一定的療效。但是其具體作用機制仍不清楚，有待進一步研究。