1,2-二羰基化合物及晚期糖基化終產物在蒸蛋糕中的形成及調控

盧永翎 陸 敏 王 茜 呂麗爽

(南京師范大學金陵女子學院，江蘇 南京 210097)

蒸蛋糕因組織膨松、味道清淡不膩，近年來廣受歡迎，其主要原料為小麥粉、雞蛋、白砂糖、食用油等。蛋糕中的油脂、蛋白質及糖類在高溫加工[1]條件下會同時發生化學和物理變化，其中美拉德反應在賦予蛋糕理想的風味及色澤的同時，易導致有害中間產物1,2-二羰基化合物如乙二醛(GO)和甲基乙二醛(MGO)的形成。高活性的1,2-二羰基化合物可進一步與蛋白質中的氨基及胍基反應形成穩定的晚期糖基化終產物(AGEs)[2]。長期攝入高含量AGEs的食物會導致體內AGEs水平增加[3]，產生一定危害，如引發糖尿病及其并發癥[4]，腎臟疾病[5]，炎癥及衰老[6]。國內外已有研究[7]證明黃酮類物質具有較好的抗糖基化作用，如槲皮素、柚皮素、表兒茶素等可以降低烘焙餅干中熒光性AGEs及GO的產生，染料木黃酮通過捕獲MGO形成加合產物從而降低體系中1,2-二羰基化合物的含量[8]，但同時研究實際加工體系中不同原料對1,2-二羰基化合物和晚期糖基化終產物影響的報道較少。

本研究擬選擇蒸蛋糕為研究對象，依據實際蛋糕加工體系，通過氣相色譜法及熒光分光光度法，探討了不同配方(糖種類、油脂種類、糕點酸度調節劑、蛋黃蛋清比例)對蛋糕中有害中間產物(GO及MGO)和終產物AGEs生成量的影響，研究其產生規律及添加食源性黃酮(木犀草素和染料木素)后對美拉德反應的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米油、大豆油、棕櫚油(不添加抗氧化劑)：南京邦基糧油有限公司；

植物黃油：上海高夫食品有限公司；

低筋小麥粉：深圳南海糧食工業有限公司；

白砂糖、紅砂糖、木糖醇：南京甘汁園糖業有限公司；

葡萄糖、D-果糖、麥芽糖、乳糖：分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司；

木糖：分析純，生工生物工程(上海)股份有限公司；

F55果葡糖漿：長春市正源食品有限公司；

糕點酸度調節劑(塔塔粉)：上海萬研食品有限公司；

染料木素、木犀草素：HPLC級(≥98%)，南京廣潤生物試劑有限公司；

乙二醛(40%水溶液)、甲基乙二醛(40%水溶液)、鄰苯二胺(99.5%)：分析純，美國sigma-Aldrich公司；

氫氧化鈉、鹽酸、二氯甲烷、乙醛、2,3-丁二酮等：分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司；

甲醇：色譜純，上海國藥集團化學試劑有限公司；

純凈水：杭州娃哈哈集團有限公司。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀：U-3000型，美國賽默飛世爾科技公司；

酶標儀：Infinite 200 Pro型，奧地利Tecan有限公司；

冷凍離心機：Eppendorf 5415型，艾本德中國有限公司；

電子天平：FA2104N型，上海精密科學儀器有限公司；

pH計：PHS-3C型，上海三信儀表廠；

攪拌機：HM520型，凱伍德有限公司；

電蒸鍋：WSYH26A型，廣東美的生活電器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 基本配方及工藝流程

(1) 基本配方：蛋清部分(蛋清100 g，糖38 g，糖種類及塔塔粉用量由試驗設計確定)；蛋黃部分(低筋小麥粉36 g，果葡糖漿16 g，水10 g，油脂30 g，油脂種類、蛋黃及黃酮用量由試驗設計確定)。

(2) 工藝流程：

1.3.2 操作要點 取新鮮雞蛋分離蛋清和蛋黃，將蛋黃部分充分攪拌均勻制得蛋黃糊，將糖分3次加入蛋清中高速攪打至干性發泡制得蛋白霜。取1/3蛋白霜加入蛋黃糊中翻拌均勻，再將其與剩余蛋白霜拌勻后分裝到尺寸為6.3 cm×4.0 cm×2.0 cm的錫紙蛋糕模具中，每份30 g，將模具在案臺上用力震2～3次，去除內部較大氣泡后置于電蒸鍋中蒸30 min，立即取出于室溫下冷卻。

1.3.3 蒸蛋糕GO/MGO及熒光性AGEs形成影響的因素

(1) 糖種類：在基本配方基礎上，玉米油添加量30 g，蛋黃添加量40 g，不添加塔塔粉及黃酮，選擇白砂糖、紅砂糖、葡萄糖、果糖、麥芽糖、乳糖、木糖及木糖醇分別添加到蛋清部分，按1.3.2方法制作，冷卻后粉碎，置于-80 ℃冰箱中備用，分析樣品中GO/MGO和AGEs的含量。同一種糖做3組平行。

(2) 油脂種類：白砂糖添加量38 g，蛋黃添加量40 g，不添加塔塔粉及黃酮，選擇玉米油、大豆油、棕櫚油、植物黃油分別添加到蛋黃部分，后續操作同1.3.1(1)。

(3) pH值：白砂糖添加量38 g，玉米油添加量30 g，蛋黃添加量40 g，不添加黃酮，分別添加塔塔粉0.0，0.5，1.0，2.0，3.0 g/100 g·蛋清，后續操作同1.3.1(1)。

(4) 蛋黃添加量：白砂糖添加量38 g，玉米油添加量30 g，不添加塔塔粉及黃酮，分別添加蛋黃0，20，40，60，80 g/100 g·蛋清，后續操作同1.3.1(1)。

(5) 黃酮：白砂糖添加量38 g，玉米油添加量30 g，蛋黃添加量40 g，不添加塔塔粉，在配方中的蛋清部分分別添加染料木素、木犀草素，添加量分別為0.05，0.10，0.30 g/100 g。后續操作同1.3.1(1)。

1.3.4 蛋糕水分、pH值的測定

(1) 水分含量：按GB 5009.3—2010執行。

(2) pH值：稱取0.4 g蛋糕粉碎樣品于50 mL離心管中，加入20 mL蒸餾水，渦旋3 min，室溫下放置1 h，用pH計測定上清液pH值。

1.3.5 熒光性AGEs量的測定 樣品中熒光性AGEs的提取：根據文獻[7]修改如下，樣品經提取后取200 μL測定Ex/Em=340/465 nm處熒光值，Gain設定為65，所有試樣均做3組平行。

1.3.6 GO、MGO的測定

(1) 樣品處理：根據文獻[7,9]修改如下，精確稱取0.5 g 蛋糕粉碎樣品于10 mL離心管中，加入5 mL 蒸餾水，渦旋3 min，8 000 r/min離心10 min，收集上清液1。于離心管中加入5 mL 50%的甲醇水溶液，渦旋混勻后超聲提取(功率150 W)60 min，8 000 r/min離心10 min，收集上清液2，將1，2上清液合并混勻，8 000 r/min離心15 min，取2 mL上清進行衍生化反應。

(2) 樣品衍生化：參照文獻[10]。

(3) 標準曲線的建立：精確量取用純凈水稀釋的0.05，0.1，0.5，1，2，5，10，20 μg/mL的GO和MGO混合溶液2 mL，采用1.3.6(2)的衍生化方法對標準品GO和MGO進行衍生化，以GO或MGO的濃度為橫坐標，GO或MGO與內標(2,3-丁二酮)的峰面積之比為縱坐標做標準曲線。

(4) 液相色譜條件：色譜柱為kromasil 100-5 C18(250×4.6 mm id，5 μm)；檢測波長315 nm。流動相A為甲醇；流動相B為0.2%(體積比)的乙酸水溶液；洗脫程序：0～25 min：32% A；25～28 min：32%～40% A；28～36 min：40% A；36～38 min：40%～50% A；38～40 min：50%～85% A；40～48 min：85% A；48～50 min：85%～32% A；50～55 min：32% A。流速0.8 mL/min。進樣量10 μL。柱溫30 ℃。

1.4 數據處理

應用SPSS 17.0分析數據，使用單因素方差分析(ANOVA)中Duncan進行檢驗(P<0.05)，不同處理的顯著性差異以不同字母表示。

2 結果與分析

2.1 液相色譜目標峰分析及標準曲線建立

利用鄰苯二胺將GO、MGO及內標2,3-丁二酮分別衍生化為喹喔啉，甲基喹喔啉，2,3-二甲基喹喔啉。目標峰具有很好的分離度及峰形(圖1)。通過色譜峰分別計算GO、MGO與2,3-丁二酮的峰面積之比，得出標準曲線GO：y=0.026 7x+0.016，R2=0.999 2；MGO：y=0.060 8x+0.021 1，R2=0.999 5。

2.2 各因素對蒸蛋糕中GO/MGO和熒光性AGEs產生量的影響

2.2.1 糖種類 由圖2可知，不同糖產生的GO/MGO含量存在顯著性差異(P<0.05)，其中果糖產生的MGO最多，木糖產生的GO最多，GO與MGO產生總量由大到小依次為木糖、果糖、葡萄糖、紅砂糖、乳糖、麥芽糖、白砂糖、木糖醇[圖2(a)]。添加木糖和乳糖時GO產生量大于MGO產生量，添加其他糖時GO的產生量均小于MGO的。對于熒光性AGEs[圖2(b)]，由大到小依次為木糖、紅砂糖、果糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、白砂糖、木糖醇。不同糖產生的1,2-二羰基化合物總量與AGEs的排序基本一致。木糖產生的1,2-二羰基化合物總量及熒光性AGEs均為最高，可能是木糖為五碳糖，在美拉德反應中五碳糖的反應活性大于六碳糖[11]。紅砂糖產生的GO/MGO及熒光性AGEs的含量均大于白砂糖，源于紅砂糖比白砂糖含有較多的礦物質、轉化糖、淀粉和葡聚糖[12]，另外，紅砂糖中金屬離子含量為白砂糖的24倍以上，金屬離子能促進美拉德反應[13]。因此，在蛋糕加工中盡量減少木糖或紅砂糖等高活性單糖的使用，減少其加工過程中美拉德反應的發生。

圖1 GO、MGO、2,3-丁二酮的喹喔啉衍生物色譜圖

Figure 1 The chromatogram of Quinoxaline derivatives of GO, MGO, and 2,3-butanedione

2.2.2 油脂 由圖3可知，4種油脂制作的蛋糕(玉米油、大豆油、植物黃油、棕櫚油)，MGO的產生量均大于GO[圖3(a)]。植物黃油產生的GO與MGO含量均最低，可能是因為植物黃油由不同植物油復配而成，在加工過程中添加了一定的抗氧化劑，如VE、特丁基對苯二酚等。研究[11]發現，植物黃油蛋糕中的CML含量低于植物油蛋糕。玉米油和大豆油的不飽和程度高，易于氧化[12]，GO含量高。油脂對熒光性AGEs生成量的影響[圖3(b)]由高到低依次為玉米油、大豆油、棕櫚油、植物黃油，玉米油產生的熒光性AGEs是植物黃油的1.4倍。由此可見，在蛋糕加工中應選用飽和程度相對較高及添加一定抗氧化劑的油脂，以減少糖基化有害產物的生成量。

圖2 糖種類對蛋糕中GO/MGO和熒光性AGEs形成的影響Figure 2 Effect of sugar on the formation of GO/MGO and fluorescence AGEs in cakes

圖3 油脂對蛋糕中GO/MGO和熒光性AGEs形成的影響Figure 3 Effect of lipid species on the formation of GO/MGO and fluorescence AGEs in cakes

2.2.3 pH 新鮮雞蛋蛋清呈堿性，隨著儲存時間的延長，堿性會增大。塔塔粉為糕點的酸度調節劑，可中和蛋白的堿性，有助于蛋白打發，增加制品的韌性[14]。分別向蛋糕中添加塔塔粉(添加范圍為0.5%～2.0%)，其pH值變化如表1。

由圖4(a)可知，隨著塔塔粉添加量的增高，pH值的降低，蛋糕中GO與MGO含量呈下降趨勢(P<0.05)。塔塔粉添加量為2.0 g/100 g·蛋清時蛋糕中的GO與MGO含量比未添加的分別下降23.76%和35.68%。熒光性AGEs的生成量隨著添加量的增加(即pH值的降低)，呈下降趨勢[圖4(b)]，蛋糕顏色也逐漸變淺。如文獻[15]報道中性偏堿的環境下有利于糖基化反應的進行。因此在蛋糕生產過程中，添加一定量的酸度調節劑，有利于減少糖基化有害產物的產生，且有助于蛋白打發。

表1 添加塔塔粉蛋糕的pH值

圖4 塔塔粉對蛋糕中GO/MGO和熒光性AGEs形成的影響Figure 4 Effect oftartar powder on the formation of GO/MGO and fluorescence AGEs in cake

2.2.4 蛋黃 蛋黃添加到蛋糕中可穩定泡沫，改善制品組織、延遲老化及保持產品良好形態[16]。由圖5可知，隨著蛋黃添加量的增加，體系中GO/MGO和AGEs的含量也呈上升趨勢。對于MGO[圖5(a)]，當蛋黃添加量為0～40 g/100 g·蛋清時，上升趨勢明顯；添加量為40 g/100 g·蛋清時達到最大值(12.74 μg/g)，是未添加蛋黃的1.5倍，之后維持不變。蛋黃的添加量對蒸蛋糕GO的形成影響不明顯[圖5(a)]。熒光性AGEs隨著蛋黃添加量增加(0～40 g/100 g·蛋清)而不斷上升，之后AGEs含量變化趨于平緩[圖5(b)]。蛋黃中含有32%～35%的脂肪[17]，且以單不飽和脂肪酸為主(50%以上為油酸)，蛋黃在熱加工過程中容易產生MGO及AGEs[18]。綜上，蛋黃添加量為40 g/100 g·蛋清時，GO/MGO和AGEs基本達到最高值；當<40%，隨著蛋黃的添加量降低有害產物均顯著降低，因此蛋糕加工中在保證品質的前提下可適當降低蛋黃的比例。

圖5 蛋黃含量對蛋糕中GO/MGO和熒光性AGEs形成的影響Figure 5 Effect of egg yolk content on the formation of GO/MGO and fluorescence AGEs in cake

2.2.5 黃酮 由圖6可知，黃酮對蛋糕中GO/MGO及AGEs的抑制率均隨著添加量的增大而提高，呈明顯的量效關系。其中木犀草素的抑制作用略強于染料木素，同種黃酮在相同濃度下對GO的抑制效果明顯高于MGO。對GO，當添加濃度為0.3%時，木犀草素抑制率達到48.15%，染料木素達到43.38%，均接近半抑制率。據報道[10,19]，黃酮通過捕獲GO/MGO從而抑制AGEs的形成。對熒光性AGEs的抑制作用見圖6(c),添加木犀草素為0.3%時，對AGEs的抑制率約達到60%。

3 結論

糖種類、油脂種類、糕點酸度調節劑添加量、蛋黃蛋清比例對蒸蛋糕中糖基化有害中間產物(GO及MGO)產生總量的影響與晚期糖基化終產物AGEs基本一致。其中不同種類的糖對GO/MGO及熒光性AGEs生成量影響差異最為顯著，在加工過程中應減少木糖或紅砂糖等高活性單糖的使用，采用添加抗氧化劑的飽和度較高的油脂，并在保證品質的前提下適量減少蛋黃的使用量。在蛋清中添加一定量的酸度調節劑(塔塔粉)不僅可以改善蛋糕的品質，也可以減少美拉德反應有害產物的生成。添加食源性黃酮木犀草素及染料木素對蒸蛋糕中糖基化反應均有明顯的抑制作用，但添加后蛋糕的質構特性及感官評定還有待進一步深入研究。

圖6 不同種類及濃度黃酮對蛋糕體系GO/MGO和AGEs的抑制

Figure 6 Inhibition of GO/MGO in the cake system with different kinds and concentration of flavonoids