普拉格雷對海水吸入型急性肺損傷的作用分析

魚高樂 韓璐瑤 高永恒 宋斯迪 金發光

淹溺是近年來意外死亡的重要原因，與淡水相比，海水由于其高滲與堿性的特點，造成的急性肺損傷更容易出現嚴重的低氧血癥與酸中毒，更易發展為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)，其救治難度更大[1]。海水淹溺的基本病理改變是肺微血管通透性增高，血管內液外滲，從而導致的肺水腫以及肺間質以中性粒細胞為主的炎性細胞浸潤[2]。

近年研究發現血小板除在凝血方面的作用外，在免疫炎癥反應以及腫瘤轉移中有著重要的作用。比如血小板可以與炎癥細胞黏附，激活炎癥細胞；血小板誘導內皮細胞黏附分子的表達，從而增加炎癥細胞的黏附與滲出；血小板釋放趨化因子以及可溶性免疫介質如CD 40 L，從而促進炎性細胞的激活與滲出[3- 5]。其中，血小板與中性粒細胞有著重要的相互關系，黏附于中性粒細胞與內皮細胞的血小板可促進中性粒細胞的遷移、黏附、滲出，同時血小板可以分泌炎性介質從而促進中性粒細胞釋放活性產物[6-7]。

抗血小板治療在一些炎癥性疾病中有著不錯的治療以及保護作用，比如對酸吸入型肺損傷、膿毒血癥及內毒素型肺損傷[8- 9]。普拉格雷通過抑制血小板表面的P2Y12受體，可抑制血小板活化與聚集反應，降低炎癥反應[10-11]。研究表明普拉格雷可以通過抑制血小板與中性粒細胞的黏附達到降低炎癥反應，從而對疾病產生保護作用[12]。鑒于海水吸入型肺損傷與炎癥反應以及中性粒細胞的密切關系，本文旨在探索普拉格雷對海水吸入型肺損傷的作用以及可能的作用機制。

材料與方法

一、實驗材料

健康雄性SD大鼠，清潔級，體重300 g左右，由空軍軍醫大學實驗動物中心提供。采用完全隨機方法將64只SD大鼠分為兩大組，即海水吸入后1 h與2 h組。每個大組中隨機分又為四組，每組8只大鼠，分別為；A:空白對照組，B：海水淹溺組，C：溶劑CMC-Na預處理組，D：普拉格雷預處理組。造模前4 h灌胃給藥。

普拉格雷購自Macklin公司，用0.5%羥甲基纖維素鈉(sodium carboxymethylcellulose, CMC-Na)溶液混懸灌胃給藥。配方海水按照中國國家海洋局第三海洋研究所海洋生化研究室提供的我國東南沿海海水的主要成分配制：NaCl 26.518 g/L，MgSO43.305 g/L，MgCl22.447 g/L，CaCl21.141g/L，NaHCO30.202 g/L，KCl 0.725 g/L，NaBr 0.083 g/L；pH 8.2，相對密度1.05，滲透壓1300 mmol/L。TNF-α、IL-1β和TXB2 ELISA試劑盒購于Bio-Swamp公司。肺泡灌洗液蛋白測定使用Bradford試劑盒，髓過氧化物酶(MPO)試劑盒購于南京建成公司。測定流式細胞所用紅細胞裂解液購于BD公司。流式抗體抗大鼠CD62P-PE抗體購于BIO-RAD公司，抗大鼠CD11b-APC抗體以及抗大鼠CD61-FITC抗體購于BD公司。

二、實驗方法

C組給與2 ml/kg CMC-Na溶劑，D組給與3 mg/kg普拉格雷(0.5% CMC-Na混懸)，B、C、D組大鼠制作海水吸入型肺損傷模型，建模后1 h或2 h后放血處死大鼠后收集肺組織標本。動物模型的制備：大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉(1.5 ml/kg)麻醉，仰臥固定于平板，大鼠頭部墊高與桌面約呈30°，正中切口暴露氣管，取1 ml的注射器插入氣管，在4 min之內緩慢勻速注入4 ml/kg海水。

心臟穿刺取血對血小板的活化影響最小。用枸櫞酸鈉抗凝，在大鼠胸骨左側偏下摸得心臟跳動最強點，用5 ml注射器呈大約20°夾角進針，有落空感后抽取血液3 ml。處死大鼠后，迅速打開胸腔，充分暴露氣管、支氣管，結扎右總支氣管，防止灌洗液流入右肺。行氣管插管，向左側緩慢注入PBS，三次共計5 ml，回收率大于90%。

三、檢測指標

1. 肺組織病理切片染色： 取大鼠右肺中葉組織，迅速放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h，脫水，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，光學顯微鏡下觀察。

2. 肺組織濕干比(W/D)測定： 取大鼠右肺下葉，擦干外表面后迅速稱得其濕重，后將標本放于60 ℃烘箱中72 h稱得干重，求出濕干比。

3. TNF-α、IL-1β和TXB2的測定： 心臟穿刺取血后血液離心后獲得血漿，用ELISA法測得其細胞因子含量，操作方法嚴格按照試劑盒說明書。

4. 肺泡灌洗液蛋白測定及MPO測定： 肺泡灌洗液離心后取上清，蛋白測定按照Bradford試劑盒嚴格操作，MPO測定按照試劑盒步驟操作，之后比色計算結果。

5. 血小板活化率及其與中性粒細胞黏附率測定： 用抗CD11b抗體標記中性粒細胞，用抗CD61抗體標記血小板，CD62P為血小板活化指標。取心臟穿刺所得血液100 μl于流式管中，避光孵育30 min后裂解，洗滌，重懸后上機檢測。流式細胞結合前向散射光、側向散射光及標志性熒光抗體圈出中性粒細胞和血小板，進而分析血小板活化率以及血小板與中性粒細胞黏附率。

四、統計學方法

結 果

一、病理學檢測

空白對照組大鼠肺泡結構清晰，未見明顯的病理結構變化；海水處理組與溶劑預處理組大鼠肺組織結構紊亂，局部肺不張，肺間質可見出血、水腫，并可見大量炎癥細胞浸潤，肺泡間隔明顯增厚；普拉格雷預處理組大鼠肺組織結構尚清晰，間質水腫、出血和炎細胞浸潤等改變較海水處理組與溶劑預處理組大鼠明顯減輕，并且海水吸入2 h較1 h病理損傷更為嚴重，見圖1。

二、 肺組織濕干比、細胞因子測定

海水吸入后，肺組織濕干比明顯增高，炎癥因子TNF-α、IL-1β和TXB2也明顯增高，2 h較1 h增高更為明顯。普拉格雷預處理有效的降低了這些指標，見圖2。

三、BALF蛋白測定、MPO測定

海水吸入后，肺泡灌洗液蛋白定量以及MPO活性也明顯增高，同時2 h增高更為明顯。普拉格雷預處理組這些指標均降低，見圖3。

圖3 不同處理組肺泡灌洗液蛋白濃度及MPO活性的比較；注：*表示P<0.05；n.s.表示無統計學差異；A：空白對照組；B：海水淹溺組；C：溶劑CMC-Na預處理組；D：普拉格雷預處理組

圖1 不同處理組大鼠肺組織的病理切片，大鼠1 h與2 h肺組織的損傷；注：A：空白對照組；B：海水淹溺組；C：溶劑CMC-Na預處理組；D：普拉格雷預處理組(HE×20)

圖2 不同處理組肺組織濕干比的比較，ELISA檢測血漿TNF-α、IL-1β及TXB2水平；注：*表示P<0.05，**表示P<0.1，n.s.表示無統計學差異；A：空白對照組；B：海水淹溺組；C：溶劑CMC-Na預處理組；D：普拉格雷預處理組

四、血小板活化率及血小板與中性粒細胞黏附率測定

海水處理組與溶劑預處理組在海水吸入后血小板活化率以及血小板與中性粒細胞黏率均明顯升高， 2 h較1 h兩項指標升高更為明顯，但普拉格雷預處理均有效的降低了血小板活化率及其與中性粒細胞之間的黏附，見圖4。

圖4 不同處理組血小板活化率以及血小板與中性粒細胞黏附率的比較；注：*表示P<0.05；n.s.表示無統計學差異；A：空白對照組；B：海水淹溺組；C：溶劑CMC-Na預處理組；D：普拉格雷預處理組

討 論

海水吸入后進入肺泡腔的高滲海水可直接導致肺水腫的形成，并且損傷肺泡上皮和血管內皮細胞，使得肺內炎癥滲出，肺泡結構受損、局部出現肺不張以及肺泡間質增厚、炎性浸潤，出現通氣換氣障礙從而引起低氧血癥。低氧血癥與肺水腫又會不斷加重炎癥反應，形成惡性循環。同時多種炎癥因子參與急性肺損傷的發生和發展，例如肺巨噬細胞激活后釋放的血小板活化因子(platelet activating factor, PAF)、TNF-α和IL-1 等以及活化的中性粒細胞與血管內皮細胞釋放的氧自由基、血栓素、前列環素等炎癥介質造成肺組織損害加重。炎癥反應的級聯放大進一步加重肺組織損傷[13]。故海水吸人后，極易出現急性呼吸窘迫綜合征，如不及時診治，病死率極高[14]。

近年來血小板在炎癥免疫反應以及腫瘤轉移方面的作用受到廣泛關注，研究表明血小板可以直接識別、捕獲、殺滅病原體，激活免疫細胞，促進炎癥細胞黏附與滲出，調節炎癥細胞的功能，例如增強其吞噬殺滅病原體以及產生中性粒細胞胞外誘捕網(neutrophil extracellular traps, NETs)[15-18]。這些功能的實現部分原因是因為血小板可以分泌釋放許多炎癥介質以及其表面分子可以調節免疫細胞的功能[19]。許多研究表明血小板與中性粒細胞之間有著密切的關系，血小板除了具有促進中性粒細胞產生NETs外，還可誘導中性粒細胞脫顆粒，增強其吞噬作用，另外血小板作為產生循環型CD40L的主要細胞可促進中性粒細胞產生活性氧[20-21]。并且血小板可促進中性粒細胞趨化、黏附、滲出到炎癥反應部位，血小板可以誘導內皮細胞上調表達黏附分子，聚集在內皮細胞上的血小板也可以介導炎癥細胞的黏附與滲出[22]。許多疾病的發生與血小板有著密切的關系，例如血小板與免疫細胞的相互作用在多發性神經硬化中(multiple sclerosis, MS)對神經脫髓鞘產生重要影響，血小板的過度激活在糖尿病發生發展中也有著重要作用[23-24]。

血小板P2Y12受體在血小板活化中有著重要作用，其受體抑制劑可有效抑制血小板活化，使血小板前炎癥反應因子釋放減少，如CD40L。另外可減少血小板P選擇素(selectin)的表達，而P選擇素已被廣泛證明可介導血小板與炎癥細胞的黏附[11]。血小板P2Y12受體抑制劑包括氯吡格雷(clopidogrel)、普拉格雷(prasugrel)等，臨床上在心血管疾病中有著廣泛的應用，對血栓性疾病有著較好的防治作用[25-26]。另外使用該類藥物進行抗血小板治療對許多疾病可產生保護作用，比如對于腫瘤轉移以及膿毒血癥[27-28]。本文結果提示，P2Y12受體抑制劑普拉格雷可抑制血小板活化，減少血小板前炎癥因子的釋放，抑制血小板與中性粒細胞的相互作用，從而降低炎癥反應以及中性粒細胞的滲出，對海水淹溺型急性肺損傷產生保護作用。實驗結果證實普拉格雷對海水淹溺型肺損傷有較好的保護作用，有效改善了肺組織的滲出與水腫，而這一作用很可能是通過抑制血小板與中性粒細胞之間的黏附以及降低炎癥反應實現的。但至于普拉格雷在降低血小板與中性粒細胞的黏附后是如何進一步影響中性粒細胞的趨化、黏附、滲出的，本實驗缺少直接的證據，其具體機制需要進一步的探索與研究。有研究表明血小板與免疫細胞的黏附率與疾病的嚴重程度以及預后密切相關，如銀屑病(psoriasis)、前列腺癌(prostatic carcinoma)等[29-30]。本文中2 h組肺損傷較1 h組明顯加重，同時其血小板與中性粒細胞黏附率同時增高，因此可以進一步研究不同程度肺損傷與此指標的相關性，以期有助于疾病的診斷與嚴重程度評估。普拉格雷等抗血小板藥物都會在一定程度上影響到凝血功能，因此也有必要在不同藥物濃度梯度下，檢測藥物對肺損傷的保護作用以及血小板與免疫細胞的黏附率，爭取用最小計量藥物對肺損傷產生較好的保護作用，避免不必要的副反應。

綜上所述，普拉格雷對海水淹溺型急性肺損傷有著較好的保護作用，可有效減輕肺組織損傷及炎性細胞浸潤等。其具體的保護機制、最佳的藥物劑量以及血小板與免疫細胞黏附率和疾病嚴重程度的相關性還需要進一步的探索研究。