芍藥苷對慢性阻塞性肺疾病的療效分析

譚 丹 曾小琴 徐 偉 周人杰

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)，是一種以氣流持續受限、進行性肺功能下降為主要特征的常見慢性呼吸系統疾病，其主要的臨床表現有咳嗽、咯痰、胸悶、氣喘，甚至呼吸困難等[1-2]。嚴重影響患者正常的工作、生活以及社交活動，甚至導致患者勞動力的喪失，使患者的生存質量直線下降，危害人類的身心健康，給家庭和社會都造成了沉重的負擔。近年來，隨著全球人口老齡化的加劇，COPD的發病率及病死率呈逐年上升趨勢，其引發的經濟負擔也隨之持續上升，預計到2020年，COPD將會占到世界排名前3位的死亡原因之一[3-5]。COPD的病理基礎為炎癥反復作用下，引起氣道重塑的不可逆性[6]。目前認為，引起COPD發病最主要的危險因素是吸煙，因為香煙中的有害成分以及氧自由基，可損傷氣管的上皮細胞、誘發肺內發生炎性反應等，從而進一步導致COPD的發生[7]。

Toll樣受體(toll-like receptor, TLR)，作為介導天然免疫的一類重要模式識別性受體，其介導的相關信號通路在炎癥發生、發展以及變化中均起著重要的作用[8-9]。不同的TLRs對應識別與其相關的病原分子模式(pathogen-associated molecular pattern, PAMP)，其中，TLR2主要為革蘭陽性菌受體，識別對應配體，可進行信號傳導并使核轉錄因子κB(nuclear factor-κB, NF-κB)活化，NF-κB活化后可啟動白細胞介素-1(interleukin-1, IL-1)、白細胞介素-8(interleukin-8, IL-8)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)等一系列的前炎性反應細胞因子發生轉錄表達[10]。目前，在西醫西藥中，尚缺乏能夠有效阻止該病病情發展的理想藥物和治療方案。研究表明芍藥苷(paeoniflorin, PF)具有抗炎、抗氧化等藥理作用，但芍藥苷在COPD領域中的研究卻尚未見文獻報道[11]。本文通過脂多糖聯合煙熏的方式建立COPD大鼠模型，觀察芍藥苷對COPD大鼠的作用，并探討其可能機制。

材料與方法

一、實驗材料

72只SD雄性大鼠，體質量180～220 g范圍內，均來自重慶醫科大學的SFP級實驗動物中心，許可證編號為：SCXK(渝)2012-0001。芍藥苷：純度≥98%，批號20161203，成都曼思特生物科技股份有限公司；孟魯司特鈉：批號20160804，四川大冢制藥股份有限公司。脂多糖：批號092M3，美國Sigma 公司；五牛牌香煙：煙氣中一氧化碳(CO)含量為12 mg，焦油含量為11 mg，煙氣煙堿含量為0.8 mg川渝中煙工業有限公司。ELISA試劑盒：R&D公司(美國)；成像系統：HITMAS-30(日本)。

二、研究方法

將72只大鼠采用“隨機數字表法”隨機分為6組：正常對照組(A組)，COPD模型組(B組)，芍藥苷低、中、高劑量組(分別為C組、D組、E組)，西藥組(F組)。其中，芍藥苷低、中、高組劑量分別為10、25、50 mg /kg；西藥組給予孟魯司特1.0 mg/kg[12]。將除正常對照組以外其余各組的大鼠全部放進煙熏箱中，12只/箱，用透明膠帶，將2只大號漏勺的凹面朝內進行固定(注意：盡量不要遮住網眼)，放置香煙(第1次放8支，之后每次放10支)，再將香煙尾部用透明膠帶固定于漏勺的手柄位置，點燃香煙，將漏勺用筷子固定于煙熏箱頂部的活動門位置，隨后關閉活動門，箱內大鼠被動吸煙，30 min/次[13]。造模周期共計52 d，第2～8天、第23～24天、第26～28天對各組大鼠均不做處理，以便大鼠體力恢復。其中，煙熏分為3階段：第1階段，每天煙熏1次(第9～22天和第29～36天)；第2階段，每天煙熏2次(第37～44 天)；第3階段，每天煙熏3次(第45～52天)，煙熏時間、次數總計： 22 d每天1次，8 d每天2次，8 d每天3次。脂多糖氣道注射總計2次，分別為第1、25天，脂多糖注射具體步驟如下：先用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，隨后仰位固定大鼠、備皮、消毒、沿縱向切開頸部皮膚、分離皮下的組織、將氣管暴露，四號針頭進行氣管穿刺，緩慢注射0.1%的脂多糖200 μl。注射完畢后，立馬直立大鼠，將其左右旋轉，以促使脂多糖可于肺中進行均勻的分布，完畢后進行皮膚縫合、消毒，最后放在溫暖鼠籠中待其清醒，清醒后再將其放回原鼠籠中。正常對照組第1、25天分別氣道注射等值生理鹽水且不予被動吸煙。造模成功后，于第2天開始給予相應藥物劑量進行灌胃，其中正常對照組給予等值生理鹽水，1次/d，連續給藥30 d。

在處死大鼠前，觀察并記錄各組大鼠毛發狀況、精神狀態等相關情況，并計算大鼠的體質量增長量，體質量增長量=處死前體質量-初始體質量。應用肺功能檢測儀測定各組大鼠肺功能相關指標，肺順應性(lungcompliance, CL)、第0.3秒的用力呼氣容積(forced expiratory volume 0.3%, FEV 0.3%)與用力肺活量(forced vital capacity, FVC)的比值、用力呼氣流量(maximum midexpiratory flow, MMEF)。

取各組的肺組織，分別提取其總蛋白，采用聚丙烯酰胺凝膠(10%)進行電泳，結合說明書，進行試驗，檢測TLR2和NF-κB的表達，最后采用ECL試劑盒進行顯影、成像[14]。每組實驗均需重復3次。

按照ELISA試劑盒中說明書指示的相關操作步驟進行，分別檢測血清和肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)中IL-1、IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α的表達水平；肺組織中相關指標的測定，先離心、得到上清液后，再按照試劑盒步驟進行檢測。

三、統計學分析

結 果

一、各組大鼠的一般情況

正常對照組大鼠毛發光滑且白皙，活動正常，精神狀態較好，飲食較好，無咳嗽；COPD模型組大鼠毛發干燥且泛黃，活動較差，精神萎靡，飲食量減少，經常性咳嗽；給藥組能明顯改善COPD模型組大鼠的上述不良情況。

二、各組大鼠體質量增長情況

正常對照組大鼠體質量增長(82.11±8.47)情況較好，模型組大鼠體質量增長(43.22±5.35)明顯欠佳，與模型組相比，給藥組大鼠的增長情況有明顯地改善(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠體質量增長情況

注：aP<0.05；bP<0.01，與模型組比較；cP<0.01，與正常對照組比較

三、各組大鼠肺功能情況

與正常對照組相比，模型組大鼠CL、FEV0.3%/FVC、MMEF均明顯下降(P<0.05)；與模型組相比，給藥組大鼠3項指標均明顯升高(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠肺功能情況

注：aP<0.05；bP<0.01，與模型組比較；cP<0.01，與正常對照組比較

四、各組大鼠TLR2、NF-κB表達情況

與正常對照組相比，模型組大鼠TLR2、NF-κB表達水平均增加(P<0.05)；與模型組相比，給藥組大鼠可抑制其表達(P<0.05)，見表3，圖1。

表3 各組大鼠肺組織TLR2、NF-κB蛋白表達情況

注：aP<0.05；bP<0.01，與模型組比較；cP<0.01，與正常對照組比較

五、各組大鼠炎癥細胞因子表達情況

與正常對照組相比，模型組大鼠IL-1、IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α均明顯增加(P<0.05)；與模型組相比，給藥組大鼠這幾項炎癥因子均明顯減少(P<0.05)，見表4。

與正常對照組相比，模型組大鼠IL-1、IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α均明顯增加(P<0.05)；與模型組相比，給藥組大鼠上述幾項炎癥因子均明顯減少(P<0.05)，見表5。

圖1 各組大鼠TLR2和NF-κB表達的wb圖

與正常對照組相比，模型組大鼠IL-1、IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α均明顯增加(P<0.05)；與模型組相比，給藥組大鼠上述幾項炎癥因子均明顯減少(P<0.05)，見表6。

表4 各組大鼠血清中炎癥細胞因子表達情況

注：aP<0.05；bP<0.01，與模型組比較；cP<0.01，與正常對照組比較

表5 各組大鼠BALF中炎癥細胞因子表達情況

注：aP<0.05；bP<0.01，與模型組比較；cP<0.01，與正常對照組比較

表6 各組大鼠肺組織中炎癥細胞因子表達情況

注：aP<0.05；bP<0.01，與模型組比較；cP<0.01，與正常對照組比較

討 論

COPD是呼吸內科的常見疾病，可直接對患者肺部功能造成影響，造成患者發生咳嗽、氣短、咳痰等臨床癥狀，進而累計全身，造成病情反反復復，引起肺功能的不斷惡化，逐漸合并各種心肺等相關并發癥，嚴重影響患者的生活質量，威脅人類的健康[15-16]。COPD具有起病較緩慢、病程較長、病情重等特點，若不及時干預或干預不當，將誘發全身性炎癥，伴隨全身各大靶器官的損傷，極易導致呼吸衰竭等。由于COPD的高患病率及高致死率，給家庭和社會造成巨大的負擔，預計到2020年，COPD將成為位居于世界疾病所造成經濟負擔排名的第五位，且現COPD發病率正呈逐年上升趨勢，情況不容樂觀[17]。目前，COPD，這種以氣流被阻塞為特點的慢性支氣管炎及肺氣腫，其發病機制尚不完全明了，研究表明COPD是由多種炎癥細胞、因子一起參與的慢性氣管炎癥性疾病[18-19]。現今普遍認為氣道、肺血管及肺實質的慢性炎癥是COPD的特征性病理學改變，在COPD的發病中有著重要的意義。巨噬細胞、中性粒細胞、T淋巴細胞等激活后，可加速釋放IL-8、TNF-α等多種炎癥因子，其中，IL-1β和TNF-α作為眾多炎癥因子中較為重要的炎癥介質前因子，可刺激IL-1、IL-6、IL-8等其他炎性介質的分泌，這些炎癥遞質可形成復雜的網絡系統，進一步不斷刺激分泌性的炎癥介質滲出、中性粒細胞溶酶體的釋放和氧自由基的生成，再反饋的促進單核巨噬細胞釋放TNF-α和IL-1等，而TNF-α在氣道炎癥形成時，可加速中性粒細胞活化的進程，導致大量中性粒細胞沉積于氣道黏膜，進而促使肺組織中的炎癥細胞發生聚集、浸潤，并造成在肺組織內損傷和修復不斷反復地交替進行，導致氣流不可逆性受限及肺泡壁損壞、肺組織纖維化及氣道結構發生重塑[20-21]。此外，TNF-α的過度表達也會導致炎癥反應發生時，患者肺組織損毀的進一步加重[22]。而IL-1β、IL-1、IL-6、IL-8等指標，特別是IL-1β是在炎癥的初始到炎癥的持續進程中都存在的炎性細胞因子。研究發現，氣道中IL-1β也可反映患者氣道中是否存在固有炎癥，且IL-1β的表達在COPD的穩定期及急性加重期表達更多[23]。同時，有研究顯示，IL-1β在COPD患者中表達增加也是造成患者病情進一步加重的原因之一[24]。故想要緩解COPD癥狀，延緩COPD的進程，抑制炎癥因子的釋放現已成為研究的熱點和方向。

TLRs作為一類新近發現的細胞表面受體，可感知病原體并可激活細胞從而產生非特異性免疫，它也是連接非特異性和特異性免疫的紐帶[25]。當微生物突破機體的屏障時，TLRs可以識別微生物，并激活機體，產生免疫應答。同時，在調控炎癥反應方面，TLRs信號通路的作用也是受到公認的。TLRs受到刺激后，可活化干擾素通路、NF-κB通路等。NF-κB作為免疫應答中重要的蛋白調節因子，也有著非常重要的作用。

關于COPD的防治方式多種多樣，對于COPD的急性期，主要使用支氣管擴張劑、抗生素和全身使用糖皮質激素等進行治療，而穩定期的患者則采取長期使用支氣管擴張劑和糖皮質激素吸入進行維持治療，但臨床提示效果不是很滿意。然而，相對于現代西醫西藥治療而言，中醫藥療效較為突出，有一定的優勢。目前雖然對于COPD有不少中醫藥相關研究，但大多深度不夠，僅局限于探討下游零散的相關因子，對機制研究甚少[26]。芍藥屬于芍藥科植物，主要存在于溫帶地區，是我國主要的藥材之一，主要的活性成分包括單貼苷類、鞣質、酚類和一些黃酮、酸、烷、揮發油、氨基酸、蛋白質等化合物，這些有效成分主要存在于芍藥苷中，其藥理作用多種多樣，應用也比較廣泛。現中醫藥大量研究已證明芍藥苷具有抗炎、抗氧化等藥理學作用，但以往關于芍藥苷抗炎的研究主要涉及頸椎間盤、腎組織、腦組織等，也有對狼瘡小鼠肺損傷保護作用的研究，但對COPD的研究卻是一片空白。本實驗采用煙熏+氣管內給予LPS的方法建立大鼠COPD模型，以芍藥苷作為研究藥物，進行了一系列初步探索。通過觀察大鼠一般情況、測定肺功能，發現芍藥苷可改善COPD大鼠毛發干燥、活動較差、精神萎靡、飲食量減少、經常性咳嗽、體質量增長欠佳等一般情況，還可提升大鼠肺順應性(CL)、第0.3秒的用力呼氣容積和(FEV 0.3%)和用力肺活量(FVC)的比值、用力呼氣流量(MMEF)，從而改善COPD大鼠的肺功能，對COPD大鼠肺功能具有一定的作用；同時，通過ELISA法檢測血清、肺泡灌洗液和肺組織中IL-1、IL-6、IL-8等炎癥細胞因子的表達，結果與正常對照組相比，模型組大鼠IL-1、IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α均明顯增加(P<0.05)，與模型組相比，給藥組大鼠這幾項炎癥因子均明顯減少，說明芍藥苷可緩解炎癥因子的釋放；通過Western blot檢測肺組織中TLR2和NF-κB的表達，結果與正常對照組相比，模型組大鼠TLR2、NF-κB表達水平均增加(P<0.05)，與模型組相比，給藥組大鼠可抑制其表達，說明芍藥苷可抑制兩者的表達。通過以上實驗結果推測，芍藥苷對COPD的作用可能是調控TLR2/NF-κB的通路。從而抑制下游炎癥因子釋放引起的。這為治療COPD提供了新的思路。但本實驗研究也存在一定的不足，影響下游炎癥因子的通路很多，不止這一條，本實驗只能初步說明芍藥苷對TLR2/NF-kB通路可能會有影響，故在后續研究中，尚需加入通路相關拮抗劑作進一步深入研究。