呼吸道病原體核酸恒溫擴增芯片十三聯檢在下呼吸道感染診斷中的價值

李艷燕 高美麗 賽亞飛 傅恩清

下呼吸道感染是指聲門以下的氣道感染，根據世界衛生組織2013年發布最新的統計結果,下呼吸道感染位列世界十大死因中的第三位(5.9%)，其導致的嚴重疾病已經成為全球關注的公共衛生問題[1]。引起下呼吸道感染的病原體主要有細菌、病毒、支原體、衣原體等[2-3]。目前臨床病原菌檢測主要依靠傳統細菌培養和血清學檢測相關抗體的方法，但由于操作方法繁瑣，獲得結果周期較長，每次只能鑒定一種病原體，且陽性檢出率低，僅有30%～40%[4]，因此建立一種高效、敏感、快速、準確的病原學檢測方法，對臨床早期診斷和精準治療有著至關重要的作用。本研究應用恒溫擴增和微流控碟式芯片相結合的技術，對13種常見下呼吸道病原體靶基因進行擴增和檢測，并與呼吸道常見病原體分離與培養檢出情況進行比較，評價LAMP十三聯檢在下呼吸道感染中的價值，旨在為臨床提供更為快速可靠的實驗室診斷依據。

資料和方法

一、一般資料

收集唐都醫院呼吸與危重癥醫學科2018年1月至2018年7月可疑下呼吸道感染患者266例，其中男194例，女72例，年齡15～92歲，平均年齡(61.22±14.66)歲。臨床癥狀主要為發熱、咳嗽咳痰，伴或不伴胸痛及呼吸困難，查體呼吸音粗糙伴或不伴干/濕性啰音，胸部X線片或胸部CT掃描等影像學提示下呼吸道感染。

二、檢測方法

1. 標本采集： 通過支氣管鏡檢查收集266例下呼吸道痰液，每例樣本量不少于0.6 ml，置于相應的無菌樣本收集管內立即送檢。

2. 儀器和試劑： LAMP十三聯檢試劑盒及 RTisochipTM恒溫擴增微流控芯片核酸分析儀購自博奧生物集團有限公司。呼吸道病原體分離與培養的試劑與材料及全自動微生物鑒定儀(VITEK2-Compact)均購自梅里埃生物公司(法國)。

3. LAMP十三聯檢： 按試劑盒要求收集、轉運、處理及提取基因組DNA核酸，采用恒溫擴增、微流控碟式芯片相結合的技術，利用具有鏈置換功能聚合酶在恒溫(65 ℃)條件下進行靶核酸擴增，熒光染料摻入法進行實時熒光檢測，應用RTisochip TM恒溫擴增微流控芯片核酸分析儀和相應軟件進行結果分析，一步完成對13種常見下呼吸道病原菌的檢測，包括肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、流感嗜血桿菌、嗜肺軍團菌、結核分枝桿菌復合群、肺炎支原體、肺炎衣原體[5]。

4. 病原體的分離與培養: 將合格的痰標本接種于血平板、加萬古霉素巧克力平板、麥康凱瓊脂平板，置于35 ℃的5%二氧化碳環境培養24 h或48 h觀察培養基，篩選可能致病菌應用法國梅里埃VITEK2-Compact全自動微生物鑒定儀進行鑒定。

三、統計學方法

所有數據均應用SPSS 22.0軟件進行處理，計數資料以百分比(%)表示，檢出率比較采用相關樣本的配對χ2檢驗，P<0.05為差別有統計學意義，檢驗結果的一致性分析采用Kappa分析，Kappa>0.4具有一致性。

結 果

一、LAMP十三聯檢對下呼吸道感染常見病原體基因的檢出情況

266例痰標本中，共檢測出呼吸道病原體陽性標本為155例，總陽性率為58.27%。單種病原體感染90例(33.83%)，混合感染66例(24.81%)，2種混合感染47例(71.21%)，3種及以上混合感染19例(28.79%)，其中以鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的混合感染為主，大腸埃希菌多為混合感染。155例陽性標本中包含11種呼吸道病原體，其中陽性率鮑曼不動桿菌占21.05%(56/266)、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌20.30%(54/266)、銅綠假單胞菌12.03%(32/266)，居于前三位。未檢出肺炎衣原體及嗜肺軍團菌，見表1。

表1 LAMP十三聯檢下呼吸道感染患者病原體分布情況[n(%)]

二、痰培養結果

微生物病原體分離培養的257例標本(排除結核感染和肺炎支原體感染)，共92例標本培養陽性，陽性率35.80%。其中鮑曼不動桿菌44株(47.83%)，銅綠假單胞菌23株(25.00%)，肺炎克雷伯菌8株(8.70%)，嗜麥芽窄食單胞菌6株(6.52%)，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌6株(6.52%)，大腸埃希菌4株(4.35%)，流感嗜血桿菌1株(1.09%)，肺炎鏈球菌及金黃色葡萄球菌未培養出。

三、LAMP 十三聯檢與培養對下呼吸道常見病原體檢出情況比較

同時進行LAMP十三聯檢與微生物病原體分離培養的257例樣本(排除結核感染和肺炎支原體感染樣本)，LAMP檢出病原體陽性標本147例，其總陽性率為57.20%(147/257)；病原體分離培養檢出陽性標本共92例，其總陽性率為35.80%(92/257)。兩種檢測結果的一致性為69.26%(178/257)，陽性符合率為32.08%(68/212)，陰性符合率為82.09%(110/134)，差異有統計學意義(χ2=23.657，P=0.000)。對于鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌，兩種方法的檢出率相一致，肺炎克雷伯、嗜麥芽窄食單胞菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，兩種方法的檢出率差異有統計學意義，LAMP十三聯檢顯著高于傳統培養法。檢出一致性較高的分別為大腸埃希菌(Kappa值0.536)、鮑曼不動桿菌(Kappa值0.637)、銅綠假單胞菌(Kappa值0.717)，見表2。

討 論

LAMP十三聯檢技術最先是在2000年由 Notomi 等[6]新開發的一種自動循環的鏈置換核酸恒溫擴增技術。其主要針對靶基因的6個區域設計4種特異引物，通過鏈置換DNA聚合酶在65 ℃的恒溫條件下完成一系列核酸擴增反應。由于該技術不需要經過模板的熱變性、高溫變性和低溫退火過程，不存在溫度變化引起的時間損耗、電泳、紫外觀察等過程，整個過程在1 h內即可完成[7-9]，大大縮短了檢驗周期。本研究采用的呼吸道病原菌核酸檢測試劑盒利用恒溫擴增芯片技術及高速數字信號處理技術相結合，使檢測方法簡單快速、試劑耗量低、自動化程度高，提高了檢測敏感性，具備了對呼吸道感染性疾病的快速診斷能力[10-13]。國內已有使用該方法檢測病原體的相關報道[14-16]，但未見國外的相關報道。

本研究對266例疑似下呼吸道感染患者的痰液樣本進行檢測，結果表明呼吸道病原體陽性標本155例，總陽性率為58.27%，單種病原體感染90例，混合感染66例，2種混合感染47例，3種及以上混合感染19例，并以銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌混合感染為主。共檢出呼吸道病原體11種，其中鮑曼不動桿菌(21.05%)、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(20.30%)、銅綠假單胞菌(12.03%)檢出率較高，而肺炎克雷伯菌、流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、大腸埃希菌的檢出率均低于10%，且大腸埃希菌不單獨存在，多于其他病原體共同存在。本研究中肺炎衣原體、嗜肺軍團菌未檢出。陳愉生等[17]的研究報道，下呼吸道感染的病原菌主要是銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌、肺炎克雷伯菌和肺炎鏈球菌。這與本研究結果不同，這可能與我院是省級三甲醫院，患者來院就診之前已經應用抗生素治療，病原菌已經耐藥，因而檢出的病原菌大多數是多耐藥或泛耐藥致病菌有關。

表2 LAMP 十三聯檢與培養法對各病原體檢測的符合率比較

注：“-”肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌培養為陰性，未做統計學分析

LAMP十三聯檢與培養的257例樣本(排除結核感染和肺炎支原體感染樣本)病原菌檢出情況相比較，病原體分離培養的陽性標本為92例，陽性率為35.80%，LAMP檢出病原體陽性標本147例，陽性率為57.20%；LAMP的陽性率顯著高于培養的陽性率，差異具有統計學意義。本研究與唐睿珠等[18]研究結果相一致。LAMP十三聯檢較傳統培養法病原體檢出率高的原因可能是：①LAMP十三聯檢是從微量拷貝中獲得目的基因，敏感性較高；②傳統培養對培養的條件要求高，培養周期較長；③傳統培養對培養的技術要求也較高，要求專門的培養基以及專業的技術人員；④部分病原體如流感嗜血桿菌，由于易受用藥的影響，使培養陽性率降低。本研究中兩種檢測方法的結果一致性為69.26%，陽性符合率為32.08%，陰性符合率為82.09%。兩種方法的陽性符合率較低，而陰性符合率較高，可能與傳統痰液培養法病原體檢出率較低有關。

本研究的缺陷是未對LAMP十三聯檢檢出的8例結核分枝桿菌復合群進一步分離與培養統計，無法進一步評價LAMP十三聯檢在肺結核中的價值。由于本研究檢出1例肺炎支原體，未檢出嗜肺軍團菌、肺炎衣原體，無法進行血清抗體檢測，所以無法評價LAMP十三聯檢在非典型病原體感染中的價值。

綜上所述，呼吸道病原體核酸恒溫擴增芯片十三聯檢較傳統細菌培養檢測更具有高效、快速、敏感、簡單及覆蓋面廣的優點，可為臨床診治提供快捷可靠的實驗室依據，對臨床早期診斷和精準治療有著至關重要的作用。