非小細胞肺癌患者EGFR突變率及與臨床病理關系和TKI靶向治療效果

張海濤 王 春 張映銘 王彩英 方申存 吳 靜 許 斌 劉 丹

肺癌為臨床常見惡性腫瘤，該病發病率及病死率在近年來呈上升趨勢，嚴重威脅人類健康及生命安全，其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)為常見類型，占所有肺癌80%，該類型肺癌生長分裂及擴散轉移較慢，雖然其治療技術在不斷改進，但放化療療效多不理想，預后較差[1-2]。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)信號通路為NSCLC形成及發展過程中至關重要的通路，其EGFR為蛋白老氨酸激酶受體，可抑制腫瘤細胞死亡，促進腫瘤細胞增殖、腫瘤血管生成與轉移，因此分析該基因突變與NSCLC患者臨床病理特征的關系對指導疾病治療有重要意義[3-6]。靶向藥物治療在NSCLC中的療效已獲得國內外腫瘤專家認可，其療效與肺癌細胞EGFR基因第19及21外顯子突變狀態關系密切，其中酪氨酸酶抑制劑(tyrosinase inhibitor ，TKI)靶向治療所用的主要藥物吉非替尼、厄洛替尼是EGFR抑制劑，對EGFR基因突變患者療效較好，且不良反應輕[7-9]。本文選取2014年5月至2016年8月我院收治的NSCLC患者100例為研究對象，分析其EGFR突變率與臨床病理關系和TKI靶向治療效果，現報道如下。

資料與方法

一、一般資料

選取2014年5月至2016年8月我院收治的晚期NSCLC患者100例為研究對象，均符合《中國表皮生長因子受體基因突變和間變淋巴瘤激酶融合基因陽性非小細胞肺癌診斷治療指南(2013版)》中NSCLC診斷標準，納入標準：①入院時卡氏評分(KPS)>60分，美國東部腫瘤協作組活動狀態評分0或1分，且具有細胞病理學診斷證據，腫瘤分期Ⅲ-Ⅳ期；②血液學、生化檢查評價器官功能正常，腫瘤直徑不超過 5 cm；③治療前均已放棄放化療治療，并簽署知情同意書[10]。排除標準：①近期使用其他治療或既往應用過鉑類聯合紫杉醇類方案化療；②不可控制且有癥狀的腦轉移，活動狀態評分>1分或其他原因無法耐受TKI化療者；③CT檢查發現癌細胞發生遠處轉移，活體檢測發現遠處淋巴結有轉移現象。

二、研究方法

1. EGFR突變率檢測： 用無菌刀片刮取5～10張8 μm厚的連續石蠟切片中癌組織區域，保證腫瘤細胞含量在30%以上，石蠟組織脫蠟后以DNeasy 組織試劑盒(Qiagen，德國)自腫瘤組織中提取DNA，應用NanoDrop 2000分光光度計(Thermo Scientific，美國)測定DNA濃度，所有DNA吸光度值A260/280均在1.8～2.0，用無水DNase水稀釋至100 ng/μl備用。采用人類EGFR基因突變檢測試劑盒(廈門艾德生物醫藥科技有限公司，中國)應用熒光聚合酶鏈反應(PCR)，依據試劑盒說明書操作，測定EGFR第18-21號外顯子的最常見29種體細胞突變情況。PCR引物：EGFR基因第18號外顯子上游引物：5’-GCTGAGGTGACCCTTGTCTC-3’(20bp)，下游引物：5’-CTCCCCACCAGACCATGA-3’(18bp)；第19號外顯子上游引物：5’-CATGTGGCACCATCTCACA-3’(19bp)，下游引物：5’-CAGCTGCCAGACATGAGAA-3’(19bp)；第20號外顯子上游引物：5’-CATGCGTCTTCACCTGGAA-3’(20bp)，下游引物： 5’-AGCAGGTACTGGGAGCCAA T-3’(19bp)；第21號外顯子上游引物：5’-CCTCACAGCAGGGTCTTCTC-3’(20bp)，下游引物：5’-TGCCTCCTTCTGCATGGTA-3’(19bp)，測序產物經NaAc與乙醇純化后，在ABI 3500XL基因分析儀上進行雙向測序，測定結果采用相關軟件進行分析。EGFR突變陽性判斷標準：循環閾值(Ct)<26；②26≤Ct<29，且ΔCt值(突變Ct-外控Ct)≤11(19-del突變、L858R突變)或ΔCt值≤7(G719X突變)或ΔCt值≤8(S7681突變、L861Q突變)。

2. TKI靶向治療方法： 選擇口服靶向藥物，服用吉非替尼片(易瑞沙，國藥準字J20100014，分裝企業：阿斯利康制藥有限公司，規格：0.25 g/片)1片/次，1次/d，口服，空腹或與食物同服。鹽酸厄洛替尼片(特羅凱，國藥準字J20120059，分裝企業：上海羅氏制藥有限公司，規格：150 mg/片)1片/次，1次/d，口服，在進食1 h或進食后2 h服用?；螓}酸埃克替尼片(凱美納，國藥準字H20110061，生產單位：浙江貝達藥業有限公司，規格：125 mg)，1片/次，3次/d。口服，在進食前1 h或進食后2 h服用，直至出現疾病進展。服藥最短1個月，最長13個月，治療后隨訪2年，口服靶向藥物期間不接受化療等其他抗腫瘤治療，并定期至我院復查CT評價療效。

三、觀察指標

(1)對EGFR突變與臨床病理的關系進行單因素與多因素Logistic分析；(2)分析NSCLC患者EGFR基因突變特點；(2)比較EGFR突變型與野生型采用TKI靶向治療的療效：近期(1年內)療效診斷標準參照實體腫瘤療效評價標準1.1版，分為完全緩解(complete remission, CR)、部分緩解(partial remission, PR)、疾病穩定(stable diseasse, SD)、疾病進展(progressive disease, PD)，達CR及PR的患者4周后再確認療效，有效率=(CR+PR)/總例數×100%；(4)應用Kaplan-Meier法分析患者1年、2年生存率，并繪制生存曲線。

四、統計學方法

結 果

一、100例NSCLC患者EGFR突變與臨床病理的單因素分析

100例NSCLC患者中，共44例發生EGFR突變，EGFR突變率為44.00%。單因素分析結果顯示EGFR突變率大小為：女性高于男性，吸煙患者高于不吸煙患者，腺癌高于非腺癌，差異對比均有統計學意義(P<0.05)，不同年齡、腫瘤分期患者EGFR突變率對比差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 100例NSCLC患者EGFR突變與臨床病理的單因素分析[n(%)]

二、100例NSCLC患者EGFR突變與臨床病理的多因素分析

多因素Logistic回歸分析結果顯示性別為女性、病理類型為腺癌是導致NSCLC患者EGFR發生基因突變的獨立危險因素(P<0.05)，見表2。

表2 100例NSCLC患者EGFR突變與臨床病理的多因素分析

三、NSCLC患者EGFR基因突變特點分析

EGFR基因突變檢測發現發生EGFR突變的基因共44例，共檢測到EGFR突變基因44個，主要類型包括18號外顯子點突變2個(4.54%)、19號外顯子缺失突變19個(43.19%)、20號外顯子插入突變及點突變5個(11.36%)、21號外顯子點突變18個(40.91%)，未發現兩種外顯子同時突變，4種外顯子中以19號和21號外顯子的突變多見，占總突變的84.09%(37/44)。

四、EGFR突變型與野生型采用TKI靶向治療的療效

正常組織沒有EGFR基因突變，均為野生型，本研究中突變型44例，野生型56例。療效分析顯示TKI靶向治療對EGFR突變型NSCLC患者的近期(1年內)有效率明顯高于野生型(P<0.05)，見表3。

表3 EGFR突變型與野生型采用TKI靶向治療的療效[n(%)]

注：CR：完全緩解；PR：部分緩解；SD：病情穩定；PD：疾病進展

五、NSCLC患者采用TKI靶向治療后1年、2年生存率分析

100例患者中，2年內獲隨訪98例，失訪1例，隨訪時間為3.0～29.1個月，中位生存時間23.6個月，EGFR基因突變型患者1年、2年生存率與野生型對比差異無統計學意義(P>0.05)，見表4、圖1。

表4 NSCLC患者采用TKI靶向治療后1年、2年生存率分析

圖1 EGFR基因突變與EGFR野生患者的生存曲線分析

討 論

肺癌是世界范圍內常見惡性腫瘤，該病在中國發病率及病死率均居腫瘤首位，5年生存率低，其中NSCLC約占所有肺癌患者80%，且該病早期不易察覺或癥狀不明顯，大多數在就診時已達中晚期甚至伴遠處轉移[11-12]。因此探討其治療方案及發病特點有重要臨床意義[13-14]。EGFR為一種跨膜蛋白，定位在細胞膜上，先以單體形式存在，當單體與配體結合后，兩個帶有配體的EGFR單體就會相互結合，形成有激酶活性的二聚體，在EGFR形成二聚體后，二聚體的磷酸激酶活性會發揮作用，腫瘤細胞中存在EGFR信號傳導通路，當EGFR過度表達或發生突變等異常，會促進細胞不斷增殖并抑制其凋亡，導致生長調節失控[15-18]。研究表明NSCLC患者EGFR突變與其性別吸煙、病理類型有關，女性患者的EGFR突變率顯著高于男性，在明確有吸煙史患者中，有吸煙史患者EGFR基因突變率明顯高于無吸煙史患者，且EGFR在肺腺癌中突變率高于非腺癌者，因此認為NSCLC患者發生EGFR基因突變與其臨床病理關系密切[19-22]。晚期NSCLC的常用治療方法包括化療、放療、靶向治療，以往常采用以鉑類為基礎的化療方案，近年來各種分子靶向藥物(如TKI)的出現，使EGFR突變陽性患者中位總生存期>2年，且這種治療針對性強、有效率高、緩解期長、毒副作用小，TKI(如吉非替尼、厄洛替尼、?？颂婺岬?是肺癌靶向治療常用藥物[23]，其療效及敏感性與EGFR基因突變狀態有關，研究發現EGGR基因位于人類第7號染色體短臂上，目前證實的有臨床意義突變點集中于第18-21號外顯子上，最多見的為19號外顯子缺失和21號外顯子點突變，約占突變總數的86%，19號外顯子缺失由于突變位點及缺失堿基長度不同而使得突變類型較多，這些位點的突變改變了EGFR胞內ATP結合區結構，提高了EGFR對TKI藥物的結合能力[24-25]。

在NSCLC患者EGFR突變率與臨床病理的關系方面，姚曉燕等[26]研究顯示，女性EGFR突變率高于男性，吸煙患者突變率較不吸煙患者高，且腺癌突變率明顯高于非腺癌患者，而多因素分析結果顯示女性、腺癌是EGFR突變的獨立危險因素，而吸煙史為非獨立相關因素，本研究結果顯示對于NSCLC患者，其EGFR突變率為：女性>男性，吸煙患者>不吸煙患者，腺癌患者>非腺癌患者，而不同年齡、腫瘤分期患者EGFR突變率比較差異無統計學意義。此外多因素Logistic回歸分析結果顯示性別為女性、病理類型為腺癌是引起EGFR發生基因突變的獨立危險因素，這與上述研究結果相近。因此NSCLC患者EGFR基因突變與病理關系密切，尤其是性別、病理類型為影響EGFR突變的獨立危險因素，但也需重視對吸煙患者及不同年齡患者的EGFR突變檢測[27-28]。在EGFR基因突變特點方面，凌云等[29]在探討非小細胞肺癌中EGFR和KRAS基因突變的特點及與臨床病理特征的關系時發現，EGFR突變類型主要包括18外顯子點突變4.0%、19號外顯子缺失突變44.5%、20號外顯子插入突變與點突變9.7%、21號外顯子點突變41.4%，以19號、21號外顯子為主，共占85.9%，本文結果顯示100例患者中共檢測到EGFR突變基因44個，分別為18號外顯子點突變4.54%、19號外顯子缺失突變43.19%、20號外顯子插入突變及點突變11.36%、21號外顯子點突變40.91%，且外顯子中以19號和21號外顯子的突變多見，占總突變的84.09%，這與上述研究結果相近。因此，EGFR的突變位點主要集中在18-21號外顯子，尤其以19號外顯子缺失和21號外顯子點突變多見。在治療有效率及生存率方面，馮衛能等[30]研究顯示腫瘤組織EGFR突變型與野生型患者EGFR-TKI治療有效率分別為69%、11.1%，兩者對比差異有統計學意義，仇曉軍等[31]在分析非小細胞肺癌58例表皮生長因子受體突變狀態時發現，EGFR突變型與野生型患者1年、2年生存率差異無統計學意義。本文顯示EGFR突變型患者采用TKI治療后，1年內治療有效率68.18%顯著高于野生型10.71%，這與上述研究結果相近。因此對于EGFR突變型患者，采用TKI靶向治療可能在近期內從中獲益，而對于野生型患者基本無效，兩者在1年內、2年內生存率對比無明顯差異，這可能與EGFR突變位點集中在18-21號外顯子有關。18-21號外顯子的突變改變NSCLC患者EGFR胞內ATP結合區結構，提高了EGFR對TKI藥物的結合能力，因而療效得以提高，雖然尚未發現EGFR突變型患者在1年、2年生存率方面獲益，但從2年的生存曲線上可看出兩條曲線有分開趨勢，隨隨訪時間延長，將會有更多患者采用TKI治療，將可能從生存上獲益，同時本文也建議在采用TKI靶向治療前，對患者進行EGFR突變檢測，綜合考慮是否選擇TKI治療方案。

綜上所述，NSCLC患者EGFR突變與其性別、病理類型關系密切，采用TKI靶向治療EGFR突變型患者近期療效優于野生型，遠期生存是否獲益可進一步開展研究。