烏蘇里擬的人工繁殖技術總結

趙道全，李先明， 謝國強，武慧慧，陳軍平，邵嘉棋，劉方磊，張瑩瑩，張鳳枝

（1.河南省水產科學研究院，鄭州450044；2.河南師范大學，河南新鄉453007）

烏蘇里擬鲿（Pseudobagrus ussuriensis），隸屬于硬骨魚綱、鯰形目、鲿科、擬鲿屬。特種中型經濟魚類，習底棲性，生活于水流緩慢的河道中。該魚野生環境中主要以底棲動物為食，3年可性成熟，體長20 cm左右，產卵期在6月中至7月末，懷卵量較少。是該科魚類中生長速度最快的種類，最大個體長度可達1 m。其脂肪含量高，肉質細嫩，味道鮮美，具有很高的食用價值和經濟價值。

1 親魚培育

1.1 池塘條件

親魚培育池塘位于鄭州市惠濟區黃河灘區東部，水泥板護坡，沙泥塘底，地下水水源，進排水方便，池塘面積2334㎡，水深保持在1.5～2.0 m。

1.2 親魚放養

共放養烏蘇里擬鲿300 kg，2940尾，放養親本各項指標如表1。

表1 放養擬鲿親本情況表

1.3 親魚馴養

馴養親魚用黃顙魚專用飼料，漂浮性飼料，飼料臺下設置2 m×2 m PVC管方框，飼料灑于方框之中，每天早上、傍晚各喂一次，將魚馴化到水面搶食，每次掌握量以魚不強烈搶食為止。

1.4 親魚的選擇

親魚雌魚挑選出腹部膨大，仰腹可見卵巢輪廓（生殖突較短），生殖孔擴張（寬而圓），手摸魚腹部松軟且富有彈性，體表無傷，體重100 g以上的個體；雄魚腹部不膨大、尾柄細長，生殖突尖而細長，生殖孔閉鎖，精巢呈鋸齒狀[1]，不易擠出精液，體質健壯，體表無傷，體重在250 g以上的雄性親魚。

2 親魚催產劑的注射

親魚的催產是人工繁殖的重要環節。催產的水溫一般在20℃以上（最好穩定在22～24℃范圍內）時，對親魚進行催產[2-3]。采取胸腔兩次注射，進針深度1 cm左右。注射分兩次進行，第一針下午17∶00～18∶00，劑量為每千克雌親魚注射LRH-A215～20 ug+HCG 10 IU，雄魚減半；針距12 h，第二天早5∶00～6∶00打第二針，劑量為LRH-A215 ug+HCG 800IU，雄魚減半。水溫20～24℃時，效應時間為24 h左右。注射完畢之后需要給予親魚流水刺激，池中保持微流水，流量在10～30 m3/h，以便更好催產成功，注水期間應時常注意水不能溢出池子。池中溶解氧保持大于5.5 mg/L。保持環境安靜，避光。

3 人工授精

由于擬鲿親魚發情行為不明顯，在催產24 h左右以后，開始人工授精，對成熟好的雌魚捕出擠卵（卵為橘黃色，卵徑平均2.0 mm）進行半干法人工授精。擠卵時應注意不能把池水帶入盆中，以免影響受精率。用提前保存好的精子適量灑在擠出的卵中，用硬雞毛不停的攪拌，使精卵更好地結合受精。

精子保存液研制是擬鲿人工繁殖規模化關鍵，我們進行了深入研究，取得突破性進展。

3.1 材料和方法

試劑：吖啶橙（AO）染液、鹽酸、Hanks精子保存液（商品購買）、hnscz精子保存液（自配優選）。

樣本：取精子研磨，分別取Hnscz和Hanks精子保存液各8 min，顯微鏡觀察后稀釋精液，根據實驗設計時間段，提前按4 h、96 h、144 h稀釋好后分別用試管標號放置于4℃冰箱冷藏保存待用[4-6]。

分別取Hnscz和Hanks保存的4 h、96 h、144 h精子各30 uL；加鹽酸吸液80 uL（反應30 s）；加AO染色液100 uL（反應3 min）；上機（貝克曼Cyto FLEX流式細胞儀）檢測[7]。

人工授精實驗分別取不同保存時間的精子與人工催產后擠出的烏蘇里擬鲿卵授精，把受精卵分別按標號放入孵化框，在孵化槽中孵化5h統計受精率。

3.2 結果與分析

3.2.1 Hnscz保存的精子上機測試結果如下圖

圖1 自制精子保存液保存精子上機測試圖

3.2.2 Hanks保存的精子測試結果如下圖

圖2 Hanks精子保存液保存精子上機測試圖

3.3 實驗分析

3.3.1 斷裂指數分析

在FSC/SSC圖上圈出精子細胞，在FL1(FITC)/FL3(ECD)散點圖上進行分析。DNA完整性好的精子主要發綠色熒光(P2門)；DNA完整性差的精子主要發紅色熒光(P4門)。通過公式計算DNA斷裂指數at來評價精子DNA質量，斷裂指數越小，精子質量越高。αt=red/(red+green)[7]。

從實驗測試圖形和數據得出以下結果：

Hnscz:

at1=6.37÷(39.03+6.37)=0.14

at2=11.28÷(40.65+11.28)=0.21

at3=9.48÷(23.23+9.48)=0.29

Hanks:

at1=9.44÷(32.10+9.44)=0.23

at2=8.29÷(17.18+8.29)=0.32

at3=18.85÷(38.54+18.85)=0.32

從以上斷裂指數結果來看，我們配置的Hnscz精子保存液保存的精子比購買的Hanks精子保存液保存的精子的斷裂指數小：Hnscz at1＜ Hanks at1；Hnscz at2＜Hanks at2；Hnscz at3＜ Hanks at3。說明自己研制的精子保存液Hnscz優于商業購買的Hanks精子保存液。

3.3.2 實驗驗證分析

表2 二種精子保存液實用效果對照

人工授精實驗結果顯示，Hnscz保存的精子144 h受精率81.4%，保持較高水平，與流式細胞儀測試的DNA斷裂指數Hnscz at3=0.29較低水平的結果相吻合；而Hanks保存的精子144 h受精率11.5%，已達到很低水平，不適宜在實際人工繁殖使用，與流式細胞儀測試的DNA斷裂指數Hanks at3=0.32較高水平的結果一致。

3.3.3 鏡檢觀察

顯微鏡觀察[8-9]，Hnscz保存液保存的精子6 d精子活力還旺盛，7 d活力開始減弱，9 d死亡；Hanks保存液保存的精子1 d、2 d活力較強，4 d活力減弱，5 d死亡。

3.4 結論

3.4.1 SCSA(斷裂指數分析)判定精子質量好壞快速準確，并能量化分析，是人工保存精子使用前檢測精子活力強弱的重要手段。

3.4.2 烏蘇里擬鲿精子保存液Hnscz經SCSA分析和實際應用檢驗，在4℃冰箱中可以人工保存一周時間并保持精子活力旺盛，是實現規模化繁殖的保證。

3.4.3 對于烏蘇里擬鲿人工保存的精子來說，根據參考資料和測試實驗結果分析認為，DNA斷裂指數at≤0.15則精子活力旺盛，保存的精子可以作為人工授精的精子來源。DNA斷裂指數at≥0.3則精子趨于衰竭，不再作為人工授精的精液來源。

4 孵化與出苗

4.1 孵化

受精卵孵化框中孵化，每4個孵化框放在一個孵化槽中，每個框放受精卵1萬粒，孵化槽采用微流水、充氣方式，每天徹底換水1次。孵化水溫保持在20℃以上，最好在22～24℃之間，孵化期間保持微流水狀態，溶解氧在6.0 mg/L以上，而在出水口一端，應不斷給過濾網進行刷洗，以免阻塞。在孵化到35 h左右時，應給網片消毒一次，采用福爾馬林溶液浸泡約60 s左右，取出放入新的孵化池中，防止霉菌發生；同時要避免陽光直射。在孵化水溫20～24℃時，從受精到出膜時間為60～70 h，孵化積溫均在60～68℃·d范圍內。

4.2 出苗

當仔魚全部孵出后，剛孵化出膜的仔魚聚集在孵化框的四個角落，全長僅為6.0 mm左右，形似蝌蚪，卵黃囊碩大并以其為營養，體質弱嫩，不能自由游泳；繼續暫養5～7 d后，仔魚全長可達1.0 cm,卵黃囊大大縮小，仔魚開始開口攝食，此時可進行魚苗培育，但暫養時，要求水質清潔、溶氧充分，還要避免陽光直射。

表3 繁殖實驗獲苗數量表

從我們繁殖5批次獲苗數量看，繁殖技術在不斷提高、成熟。

5 魚苗培育

魚苗培育主要是將水花培育成2.5～3.5 cm的夏花魚苗，可選擇在水泥池和池塘中進行，本文以池塘培育作介紹。

5.1 池塘消毒

選擇水質良好水源充足無污染的魚池，面積1500～2000 m2，消毒須選擇晴天進行，放養前6～8 d，用生石灰50～75 kg/667㎡或漂白粉7～10 kg/667㎡溶解化漿后全池潑灑。魚塘消毒5 d后將水加至60～70 cm，施基肥150～200 kg/667㎡腐熟的牛糞，以培肥水質，增加水中生物餌料[10-11]。

5.2 放養密度

池塘投放密度5～6萬尾/667 m2的水花，投放一定數量的鰱、鳙魚夏花或魚種，鰱、鳙比例為3：1，以調節水質。

5.3 投喂

采用肥水（浮游動物大量繁殖）下塘與人工投喂飼料相結合的飼養技術。魚苗下塘后以人工培養的浮游動物為食，約可維持5 d左右，從第5 d開始進行人工投喂，在以后的5 d內靠岸邊潑灑豆漿，每日4次，每次25 kg/667 m2左右；而在達第10 d時可以開始潑灑豆漿與粉料的混合料，每日4次，每次30 kg/667 m2左右，每桶中加入一碗粉料混勻即可；在喂養達15 d時可完全潑灑粉料，每日4次。同時還需要根據天氣變化，魚苗的攝食情況靈活調整投喂量；而在投喂時可適當的加入微生物制劑如光合細菌等作為飼料添加劑，一方面可防止水體惡化，同時也可以增強魚體抗病率。加強培育期間的水質管理，定期加注新水[13-14]。

5.4 分池

經過20 d左右的培育之后，可長成2.5～3.5 cm的夏花苗，成活率在95%左右。停食拉網鍛煉后分池進行下一階段的飼養，避免密度過大影響生長。此魚具有集群性和避光性，在培育池中可栽種一定量的水草充當遮蔽物。

6 小結

烏蘇里擬鲿人工繁殖取得成功，催產率達96%，受精率最高達98.2%，平均達93%，孵化率達75%，經過5批次試驗，繁殖技術逐漸成熟，繁殖水花魚苗30萬尾；自主創新研制了擬鲿專用精子保存液，并建立了基于SCSA精子保存液使用效果的評價體系。