高效液相色譜檢測魚肉中游離棉酚含量方法的建立

（河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453007）

我國是棉花種植大國，棉籽年產(chǎn)量達(dá)1000萬t以上，壓榨后所得棉籽餅產(chǎn)量高達(dá)600萬t以上。棉籽粕的粗蛋白含量為35-40%，營養(yǎng)豐富、價格低廉，是畜禽、水產(chǎn)動物飼料源蛋白重要來源之一[1-2]。然而，由于棉籽粕中含有游離棉酚，長期攝食含有棉酚的飼料，游離棉酚會蓄積在動物體內(nèi)，影響人類食用安全。有研究表明，人類食用含有棉酚的食物后可引起低血鉀癥、肝臟和腎臟損傷，甚至可造成女性月經(jīng)紊亂、閉經(jīng)，男性不育[3-8]。上世紀(jì)六十年代發(fā)生在山東高密、河南夏邑及河北邢臺的男性不育現(xiàn)象，經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)與該地區(qū)長期食用土榨棉籽油有關(guān)[9]。對于游離棉酚在食品中的殘留限量，世界衛(wèi)生組織、聯(lián)合國兒童基金會建議不超過600 mg/kg[10]，美國FDA規(guī)定不超過450mg/kg[11]，我國規(guī)定食用植物油中不超過200mg/kg[12]。關(guān)于植物性食品或飼料中游離棉酚檢測方法已有較多報道[13-16]；動物性食品中游離棉酚檢測方法僅見崔曉明等[17]研究報道，該方法采用高效液相色譜法（HPLC）檢測了畜肉中游離棉酚含量，但其提取溶劑劑量相對較多，處理過程相對耗時。文獻(xiàn)報道檢測動物組織中游離棉酚仍多是采用飼料中游離棉酚檢測方法[18-20]，前期樣品處理過程比較繁瑣，使動物性食品游離棉酚檢測效率大大降低。相對禽畜肉，魚肉中脂肪含量較低，無需繁瑣的去脂肪過程。本研究建立了魚肌肉中游離棉酚的高效液相測定方法，樣品處理過程相對簡單，準(zhǔn)確度高，以期為魚肉中棉酚安全評價提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

鯉魚幼魚，購于鄭州某養(yǎng)殖場，體質(zhì)量50-60 g，流水養(yǎng)殖，水溫24-26℃。

1.1.2 藥品與試劑

醋酸棉酚標(biāo)準(zhǔn)品（含量≥98.0%），購于大連美侖生物技術(shù)有限公司。甲醇、乙腈和磷酸均為色譜純。

1.1.3 實驗儀器

高效液相色譜儀Agilent 1260，Eppendorf高速離心機，ZG圓形水浴氮吹儀，XHF-DY內(nèi)切式均漿機。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件

高效液相色譜儀為Agilent 1260，色譜柱為Agilent TC-C18（長度250 mm，內(nèi)徑4.6 mm，粒徑5 μm）；流動相為甲醇:磷酸=85:15(v:v)，磷酸濃度0.01 mol/L，pH值2.43；紫外檢測波長235 nm，柱溫40℃，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣體積20 μL。

1.2.2 磷酸溶液配制

準(zhǔn)確量取580 μL 85%色譜級磷酸，用超純水定容至1 L，磷酸濃度0.01 mol/L，測得pH為2.43。

1.2.3 不同溶劑溶解游離棉酚穩(wěn)定性

純丙酮溶液：準(zhǔn)確稱量醋酸棉酚0.0102 g，用純丙酮定容至50 mL，超聲波超聲30 min，配置成200 μg/mL的棉酚標(biāo)準(zhǔn)儲存液，再利用純丙酮稀釋成10 μg/mL的棉酚標(biāo)準(zhǔn)工作液。

丙酮-水溶液：準(zhǔn)確稱量醋酸棉酚0.0102 g，用70%丙酮水定容至50 mL，超聲波超聲30 min，配置成200 μg/mL的棉酚標(biāo)準(zhǔn)儲存液，再利用70%丙酮水稀釋成10 μg/mL的棉酚標(biāo)準(zhǔn)工作液。

丙酮-磷酸溶液：準(zhǔn)確稱量醋酸棉酚0.0102 g，用70%丙酮磷酸定容至50 mL，超聲波超聲30 min，配置成200 μg/mL的棉酚標(biāo)準(zhǔn)儲存液，再利用70%丙酮磷酸稀釋成10 μg/mL的棉酚標(biāo)準(zhǔn)工作液。

穩(wěn)定性測定：每天上午10:00在1.2.1的色譜條件下分別測定純丙酮、70%丙酮水、70%丙酮磷酸三種不同的游離棉酚溶液的響應(yīng)值峰面積，連續(xù)測定5天后分別比較它們的變異系數(shù)(C·V%)，以此衡量各種溶液的穩(wěn)定性。

1.2.4 醋酸棉酚標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱量醋酸棉酚0.0102g，用70%丙酮磷酸定容至50mL，超聲波超聲30min，配制成200μg/mL的棉酚標(biāo)準(zhǔn)儲存液，再利用70%丙酮磷酸依次稀釋成100μg/mL、50 μg/mL、20 μg/mL、10 μg/mL、5μg/mL和1μg/mL的棉酚標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.5 回收率和精密度的測定

取濃度為1、5、10 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到1 g空白組織中，組織勻漿機12000 r/min勻漿10 s，然后用2 mL丙酮清洗刀頭2次，合并3次液體，漩渦振蕩10 s，4500 r/min離心15 min，吸取上清液轉(zhuǎn)移至新10 mL離心管中，置-20℃冰箱冷凍過夜。冰箱中取出后，4500 r/min離心10 min，取上清液至10 mL玻璃離心管中，30℃氮氣吹干。殘渣用1 mL丙酮-磷酸（7：3）溶液定容，漩渦振蕩10 s，超聲波超聲5 min，0.22 μm有機濾膜過濾后置-20℃冰箱冷凍過夜，次日再次利用0.22 μm有機濾膜過濾后用于濃度測定。每個濃度設(shè)3個重復(fù)，測得各樣品峰面積按標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算濃度，然后與理論濃度相比較。

將上述樣品于1 d內(nèi)分別重復(fù)進(jìn)樣5次，分5 d測定，計算各濃度水平響應(yīng)值峰面積的變異系數(shù)，以此衡量檢測方法的精密度。

1.2.6 棉酚標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別取100 μg/mL、50 μg/mL、20 μg/mL、10 μg/mL、5 μg/mL和1 μg/mL的棉酚標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL加入到1 g空白組織中，每個濃度設(shè)三個重復(fù)，按照前述“提取量”方法處理。以質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo)，以峰面積作為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.7 樣品制備與處理

準(zhǔn)確稱取醋酸棉酚標(biāo)準(zhǔn)品0.0969 g，加入10 mL滅菌生理鹽水，超聲波超聲30 min，配制成9.686 mg/mL懸濁液，吸取0.1 mL灌胃，以20 mg/kg體質(zhì)量劑量每天灌胃1次，連續(xù)灌5天。將鯉魚解剖，取肌肉冷凍保存，備用。

準(zhǔn)確稱量魚肉樣品1 g（精確到0.01 g）于10 mL離心管，加入2 mL丙酮，組織勻漿機12000 r/min勻漿10 s，然后用2 mL丙酮清洗刀頭2次，合并3次液體，按照前述1.2.5方法處理。

2 實驗結(jié)果

2.1 峰形判別

在本實驗條件下，醋酸棉酚色譜峰峰形良好，棉酚保留時間在17.2 min左右，如圖1所示。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1游離棉酚色譜圖

本實驗條件下，醋酸棉酚在0.5～10 μg/g范圍內(nèi)有良好的相關(guān)性，魚肉中游離棉酚標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=59.446X-3.5888(R2=0.9981)，如圖2所示。最低檢測限為0.5 μg/g。

2.3 穩(wěn)定性

圖2 肌肉中游離棉酚標(biāo)準(zhǔn)曲線

由表1可知，同用純丙酮和70%丙酮水配制而成的棉酚相比，70%的丙酮磷酸配制而成的棉酚溶液的變異系數(shù)最低為2.25%，所以其穩(wěn)定性最好。

2.4 準(zhǔn)確度和精密度

表1 不同提取溶劑溶解游離棉酚穩(wěn)定性差異

在本實驗條件下，肌肉中加入1 μg/g、5 μg/g、10 μg/g三個濃度游離棉酚標(biāo)品后，回收率均高于96%，變異系數(shù)小于10%，符合生物測定方法要求。

2.5 樣品檢測

表2 魚肉中游離棉酚檢測回收率和精密度

按體質(zhì)量以20 mg/kg劑量連續(xù)5d口灌鯉魚游離棉酚后，測定其肌肉中棉酚含量，峰面積為53.22（圖1），帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得0.96 μg/g。

3 討論

游離棉酚屬于易氧化的親脂性化合物，結(jié)構(gòu)中含有共軛雙鍵，具有較強的紫外吸收，因此可利用紫外檢測，測定方法有苯胺法、間苯三酚法[21]、高效毛細(xì)管電泳法（HPCE）[22]、高效液相色譜法（HPLC）[23]和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（UPLC-MS/MS）[24]。與苯胺比色法、間苯三酚法和HPCE法相比，HPLC和UPLC-MS/MS靈敏度高，但UPLC-MS/MS檢測成本較高，目前主要采用HPLC測定游離棉酚。欒姝等[14]以甲醇-1%磷酸作為流動相，丙酮、乙醚、甲醇作為提取溶劑，比較了三種提取劑提取棉籽仁中游離棉酚的提取率，結(jié)果顯示丙酮提取率最高。陳來等[15]利用丙酮提取棉籽粕中游離棉酚，經(jīng)超聲、離心、抽濾、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)處理后，以乙腈-0.2%磷酸作為流動相檢測棉酚含量，穩(wěn)定性好、靈敏度高。劉揚等[16]以甲醇作為提取溶劑，提取食用植物油中游離棉酚，上清液用氮氣吹干后用乙腈-0.1%甲酸定容，經(jīng)過C18柱分離，以乙腈-0.1%甲酸水作為HPLC流動相，可準(zhǔn)確檢測食用植物油中棉酚含量。邸萬山[25]以BHT為內(nèi)標(biāo)物，通過HPLC也可準(zhǔn)確測定棉籽油中游離棉酚含量。姚軍等[26]以丙酮-乙腈-正庚烷-磷酸鹽溶液作為提取劑，提取家兔血漿中游離棉酚后離心取上清，微孔濾膜過濾后直接進(jìn)行HPLC測定，無需進(jìn)行蒸干濃縮，操作簡單，可用于棉酚在動物體中蓄積及毒性評價。

關(guān)于動物食品中游離棉酚測定尚未有國標(biāo)方法，僅見崔曉明等[17]建立了一種HPLC測定肉樣中游離棉酚含量的方法，該方法取5 g肉樣，每次用25 mL丙酮-水重復(fù)提取兩次，冰箱中冷藏過夜，之后利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮定容，取上清測定。而水產(chǎn)動物肌肉中游離棉酚含量測定多采用的是GB 13086-1991《飼料中游離棉酚的測定方法》中的苯胺比色法[18,20]。根據(jù)欒姝等[14]研究結(jié)果，本方法在選取1 g樣品條件下，優(yōu)化了丙酮提取劑量，確定了丙酮最佳提取劑量，有效降低了檢測成本。同時采用組織勻漿機破碎組織，與超聲破碎相比，速度快，效果好。而在去脂肪步驟，參考崔曉明等[17]報道方法，本實驗將上清液置于-20℃凍存12 h后再進(jìn)行離心，由于魚肉中脂肪含量較低，通過本方法即可有效去除脂肪，其費用遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于使用C18柱去除脂肪成本。當(dāng)長期攝食含有棉酚的飼料后，肌肉中游離棉酚含量較低，在30-50 μg/g[18,20]。本方法準(zhǔn)確度高，變異系數(shù)小，最低檢測限達(dá)0.5 μg/g，滿足魚肉中游離棉酚定量檢測，可為魚肉中游離棉酚安全評價提供技術(shù)支撐。