草魚源嗜水氣單胞菌的毒力與耐藥性檢測

（河南師范大學水產學院河南新鄉453007）

草魚 (Ctenopharyngodon idellus)是四大家魚之一，肉質鮮美，經檢測含有大量的不飽和脂肪酸，有利于人體血液循環，因此是廣大消費者餐桌上較常見的魚類之一；其次，草魚個體較大，生長迅速，是我國重要的淡水養殖魚類[1]。但由于近年來草魚的養殖規模和養殖地區的不斷擴大以及生態環境的惡化，草魚因感染細菌性病原而致病的事例逐漸增多[2]。

嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)屬于弧菌科，氣單胞菌屬，能從自然水體、土壤和魚體中分離檢測到，是水產動物的條件致病菌，在魚體抵抗力下降或者環境條件惡劣時感染魚類可導致斑點叉尾鮰（Ictalurus punetaus）套腸病、腹水病，淡水養殖魚類患危害性較大的細菌性敗血癥，中華鱉（Trionyx sinensis）患紅底板病、腐皮病等[3-7]，也能感染鳥類、爬行類和兩棲類動物致使其出現不同程度的發病癥狀[8]。在一定條件下，人類感染嗜水氣單胞菌后，出現腹瀉、腸炎等疾病，嚴重者導致敗血癥[9]。嗜水氣單胞菌為目前普遍存在的一種人-畜-水生動物共患病原菌[10]。2017年5月份，新鄉郊區某漁場養殖的草魚出現腹部膨大，紅腫出血等癥狀，為查明該漁場草魚死亡原因，本實驗對分離純化的病原菌進行了形態觀察、人工感染、gyrB基因鑒定以及藥敏試驗，旨在為草魚感染細菌性疾病的科學防控提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 實驗魚

本研究所用患病草魚魚體質量為84-96 g，體長14-16 cm，取自新鄉郊區某養殖場，發病癥狀表現為鰓絲末端腐爛，腹部膨大，肝脾糜爛。

供試鯽魚（Carasstus anratus）取自河南師范大學水產養殖基地，魚體質量為18-24 g，體長10-11 cm。選取體質健康的個體用于人工感染實驗。

1.2 細菌分離鑒定

1.2.1 細菌分離

在無菌條件下使用接種環蘸取發病草魚的脾臟、肝臟等組織，分別劃線接種于TSA培養基上進行分離純化培養，選取代表性菌株AH-16進行常規革蘭氏染色，使用光學顯微鏡觀察分離菌株的染色特性。

1.2.2 人工感染

供試鯽魚暫養7天，挑選體質健康的50尾個體，將其隨機分為5組，放在直徑為60 cm、深度為100 cm的圓桶里，水溫保持在25±1℃，不喂食，每天換1/3水。將分離菌株AH-16按照等對數間距設置實驗濃度梯度，配制成7.90×107cfu/mL、1.96×107cfu/mL、4.94×106cfu/mL、1.24×106cfu/mL 4個梯度的菌懸液，按200 μL/尾的劑量分別對供試鯽魚進行腹腔注射，腹腔注射200 μL的無菌生理鹽水，攻毒后定時查看鯽魚的存活情況以及做好記錄，飼養觀察2周。并根據攻毒后不同濃度菌懸液下的死亡情況，計算死亡率，且該病原菌的半致死濃度LD50值參照半數效量累積法（Reed-Muench法）[11]進行計算。

1.2.3 gyrB基因的PCR擴增

使用CTAB法提取純化細菌的基因組DNA[12]，PCR擴增所用引物gyrB-F：5'－TCCGGCGGTCTGCACGGCGT-3'，gyrB-R：5'-TTTCCGGGTTGTACTCGTC-3'。反應體系：2×Es Mix 10 μL、DNA 1 μL、上下游引物各1 μL、添加ddw 至20 μL。PCR的反應條件為：94℃預變性4 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸60 s，72℃終延伸 10 min。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，出現特異性良好的目的條帶，將PCR產物送至上海生工生物公司進行測序把測序結果進行BLAST搜索，使用MEGA 6.0軟件構建系統進化樹。

1.3 藥敏試驗

選用阿莫西林、羅紅霉素、奈啶酸、復方新諾明、頭孢噻肟、妥布霉素等22種抗菌藥物，藥敏試驗按照常規紙片擴散（K-B）法進行操作[13]，首先制備優勢菌株AH-16的菌懸液，向菌懸液中加入經高溫滅菌的生理鹽水稀釋為1×108cfu/mL，然后吸取100 μL稀釋后的菌懸液均勻涂布于MH瓊脂平板，把藥敏紙片分別貼到經自然晾干的培養基上，每一個平板貼3片相同的藥敏紙片，28℃恒溫過夜培養，測量抑菌圈的直徑，結果取3個數值的平均數。分離菌株的藥敏紙片結果分析參照文獻[14-15]中的標準進行判定。

2 結果與分析

2.1 菌株鑒定

2.1.1 分離菌的特征

從患病草魚體內分離的細菌接種到TSA培養基上經過純化培養后獲得一批形態一致的優勢菌，菌落形態為卵圓形、邊緣光滑、乳白色，中央隆起（圖1）。革蘭氏染色陰性，呈短桿狀，兩端鈍圓，排列形式為單個或多個，細菌大小長約1-2 μm（圖2）。

2.1.2 人工感染

圖1 分離菌株AH-16的菌落形態Fig.1 Colony morphology of isolated strain AH-16

圖2 分離的菌株AH-16的革蘭氏染色結果Fig.2 Gram staining results of isolated strainAH-16

將配制好的不同濃度的菌懸液對健康鯽魚進行腹腔注射后，鯽魚的死亡情況詳見表1，結果顯示，菌懸液濃度為7.90×107cfu/mL實驗組的鯽魚48 h內死亡率達100%，死亡鯽魚發病癥狀與新鄉郊區某養殖場自然發病的草魚的癥狀類似，主要表現為鰓絲末端腐爛，腹部膨脹，胸部出血，肝脾糜爛。1.96×107cfu/mL濃度組的鯽魚48 h內死亡率為80%；菌懸液濃度為4.94×106cfu/mL和1.24×106cfu/mL實驗組中，鯽魚在48 h內均未出現死亡現象；對照組在48 h內全部沒有死亡。使用Reed-Muench法計算出分離菌AH-16對鯽魚的LD50為1.2×107cfu/mL。

表1 鯽魚的人工感染試驗Table 1 Artificial infection test of healthy Crucian carp

2.1.3 gyrB基因的PCR擴增

分離菌株AH-16的PCR檢測結果如圖3所示，由圖3可知，PCR擴增獲得了大小約為1100 bp的目的基因，與預期擴增片段大小相符。將測序結果進行Blast搜索，使用MEGA 6.0建立系統進化樹（圖4），結果顯示分離菌株AH-16與嗜水氣單胞菌標準株(HQ326180.1)的同源相似度為99%，嗜水氣單胞菌和分離菌株AH-16在系統進化樹中聚為一支，則該致病菌AH-16為嗜水氣單胞菌。

圖3 分離菌株AH-16的PCR檢測結果注：M為DL5000 Marker;1為分離菌株的PCR檢測結果Fig.3 PCR detection results of isolated strain AH-16Note:M is DL 5000 Marker;1 is the PCR detection result of the isolated strain

圖4 分離菌株AH-16的gyrB基因序列系統進化樹Fig.4 Syetematic phylogenetic tree of gyrB gene sequence of isolated strain AH-16

2.2 藥敏試驗

通過紙片擴散法測試了菌株AH-16對22種藥物的敏感性，具體結果詳見表2。結果顯示，AH-16對頭孢噻肟、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、四環素、強力霉素、氯霉素、復方新諾明、恩諾沙星和萘啶酸等11種藥物敏感；中度敏感的抗菌藥物有紅霉素、妥布霉素、多黏菌素B；而對青霉素G、阿莫西林、頭孢氨芐、頭孢唑啉、頭孢拉定、羅紅霉素、磺胺異惡唑、利福平等8種抗生素產生耐藥。

表2 AH-16對不同抗生素的敏感性Table 2 Sensitivity of Pathogen AH-16 to different Antibiotics

3 討論

3.1 嗜水氣單胞菌的致病性

近年來隨著我國養殖產量和養殖品種不斷增加，水產動物疾病也頻繁發生，其中最為常見的是由氣單胞菌屬細菌感染引起的細菌性魚病。氣單胞菌屬細菌是自然環境中的常在菌，養殖水體、污水、土壤和水生動物體表都能人為分離檢測到嗜水氣單胞菌，在特定條件下，可使水產動物致病，當魚體抵抗力下降、體表損傷或環境條件惡劣等條件下可導致其發病。研究顯示，魚類、牛蛙、龜鱉等水產養殖動物如果被嗜水氣單胞菌感染后都能患病，若伴隨養殖環境惡化，則可出現爆發性死亡[16]。在本研究中，利用從患病草魚體內分離出的嗜水氣單胞菌AH-16對健康鯽魚人工感染，結果顯示嗜水氣單胞菌可以在較短時間內使鯽魚出現大量死亡現象，且出現死亡的魚體表現出肝脾糜爛，出血，腸道出血發紅等與自然發病草魚的癥狀一致，可以確定AH-16菌株是導致草魚患病的病原菌。攻毒結果顯示，嗜水氣單胞菌對鯽魚的LD50值為1.2×107cfu/mL，參照濮俊毅等[17]研究中對細菌毒力的判定標準，LD50在106-107cfu/mL內的菌株則具有較強的毒力，顯示本研究中患病草魚分離菌AH-16具有較強的致病力。細菌的致病性取決于溶血素、S層蛋白及胞外蛋白酶[15]等毒力因子，嗜水氣單胞菌產生的毒素可引起生物體廣泛而復雜的病理變化，以體表和內臟器官的急性出血癥狀為多，從AH-16菌株的人工感染中可見，嗜水氣單胞菌對健康鯽魚有較強的致病性。

3.2 嗜水氣單胞菌病的科學防治

嗜水氣單胞菌病對水產養殖業危害嚴重，養殖者深受該疾病困擾。由于抗菌藥物的使用具有操作簡單、成本較低、效果較好的特點，在相當長的時期內抗菌藥物的使用仍是水產養殖細菌性疾病防治的常用方法，但是由于養殖者在養殖過程中對抗菌藥物的不合理使用，致使耐藥細菌的出現，進而影響到疾病治療效果。本實驗采用22種抗菌藥物對病原菌AH-16進行藥敏試驗，結果顯示：AH-16對頭孢噻肟、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、四環素、強力霉素、氯霉素、復方新諾明、恩諾沙星和萘啶酸等11種藥物敏感（其中氯霉素為國家禁用藥物，因此氯霉素僅用于本次藥物敏感試驗），而對8種抗菌藥物表現出耐藥，顯示出嗜水氣單胞菌AH-16為一種多重耐藥性菌株，對多種抗菌藥物產生抗性。因此在實際生產中可在對分離菌株有抑制作用的藥物中選擇一種或者幾種符合國標的藥物對養殖魚體進行治療。

嗜水氣單胞菌的來源不同，對抗生素的敏感程度也有差異，徐先棟等[18]的研究顯示嗜水氣單胞菌對新霉素、四環素、氯霉素敏感；陳言峰等[19]研究的研究結果表明，嗜水氣單胞菌對慶大霉素、強力霉素敏感，而對利福平耐藥；而梁利國等[20]的報道顯示嗜水氣單胞菌對鏈霉素和復方新諾明表現出高度的敏感，對阿莫西林表現耐藥。楊寧等[21]的實驗顯示嗜水氣單胞菌對恩諾沙星、復方新諾明耐藥，對妥布霉素敏感。綜合不同研究者結果的差別可知，養殖地條件、養殖種類和用藥方法的差異導致病原菌所處的環境有所不同，從而在藥敏試驗檢測中出現不同的結果。隨著養殖技術的提高和養殖密度增加，水產養殖中疾病頻發，對于一些細菌性疾病，養殖者通常使用抗菌藥物進行控制，但由于長期使用單一種類的抗菌藥物，致使病原菌對某些抗生素產生耐藥性，且造成養殖環境的污染，因而養殖過程中暴發的疾病越來越難以防治。因此，養殖中對細菌性疾病的防治既要考慮病原菌對藥物的敏感性，也要根據漁藥的相關規定合理用藥。在選擇和使用抗生素時應嚴格按照相關規定進行，為了提高抗生素的使用效果，減少細菌性病原對藥物產生耐藥性，更不應該長期使用同一種抗生素，應做到科學且精準使用抗菌藥物。