玉米ZmPP2C6-01基因的克隆及表達分析

袁 珍，張鵬鈺,2，王國瑞，曹麗茹,2,3，庫麗霞,2，衛 麗

(1.河南農業大學 農學院，國家小麥工程技術研究中心，河南 鄭州 450046；2.河南糧食作物協同創新中心，河南 鄭州 450046；3.河南省農業科學院，河南 鄭州 450046)

玉米是我國主要的糧食作物，其生長發育過程中經常會遭遇干旱等非生物脅迫的影響，造成不可估量的經濟損失。胡瑞法等[1]研究表明，限制不同地區玉米生產發展的第一因素是干旱(除西南地區旱地秋玉米外)，干旱嚴重影響玉米生長,造成產量下降甚至絕產。植物在長期的進化演變過程中,逐漸形成感受、傳遞干旱信息的系統及一系列生物反應機制來應對脅迫，從而降低干旱脅迫對機體的傷害[2]。植物對干旱信號的感知、傳遞及抵御過程涉及一系列抗逆相關基因的表達調控。

由蛋白磷酸酶和蛋白激酶介導的蛋白質可逆磷酸化在植物逆境信號傳遞過程中發揮重要調控作用。蛋白磷酸酶2C (Protein phosphatese 2C，PP2C) 是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶，在生物體中以單體酶的形式存在，其活性依賴于Mg2+或Mn2+[3]。植物中PP2C類蛋白數量豐富，在PP2C類蛋白的N-或C-末端含有一個保守的催化結構域，另一端含有一個復雜多變的區域，其結構的多樣性表明PP2C類蛋白在信號傳導過程中具有不同的功能[4-6]。諸多研究表明，植物中PP2C類蛋白在信號轉導中起著非常重要的調控作用，尤其在干旱、高鹽及低溫等環境脅迫所誘導的信號轉導途徑中[4]。Miyazaki等[7]發現，在冰葉日中花中有10個PP2C類磷酸酶基因(Mpc1-Mpc10)，其中，干旱脅迫下Mpc5在根中的表達量上升，高溫脅迫下Mpc8在葉中的表達量升高。對煙草Ntpp2c1基因的轉錄水平進行研究發現，干旱脅迫能強烈而持續地誘導Ntpp2c1基因表達；而熱激卻使之表達水平迅速降低[8]。過表達鳶尾IrisPP2C1基因的轉基因擬南芥可提高對ABA的敏感性，暗示IrisPP2C1基因在ABA信號調控過程中起正調控作用[9]。藜苜蓿中MtPP2C8基因在干旱、低溫、ABA處理下顯著上調表達[10]。過表達BdPP2CA6基因的轉基因擬南芥植株耐鹽性提高[11]。干旱、ABA和鹽脅迫可高度誘導水稻PP2C家族A亞族基因OsPP108、MsPP2C的表達，過表達OsPP108、MsPP2C的轉基因擬南芥耐鹽性提高[12-13]。谷子PP2C家族A亞族基因都能被ABA誘導表達，部分基因被PEG、高鹽、低溫和低氮脅迫誘導表達[14]。山毛櫸中FsPP2C1/C2基因在ABA信號途徑中起正調控作用, 在擬南芥中過表達山毛櫸中FsPP2C1/C2基因可增強轉基因植株對非生物脅迫的抗性[15-16]。而Liu等[17]研究發現，在非生物脅迫下，ZmPP2C基因的組成型表達降低了植物在種子萌發和幼苗生長期間對干旱和鹽的耐受性，同時降低了轉基因擬南芥對ABA的敏感性。Santiago等[18]報道，過表達PP2Cs家族的HAB1基因導致轉基因擬南芥抗旱性減弱，說明PP2C在逆境響應中起負調控作用。FaABI1編碼的蛋白磷酸酶PP2C1負調控果實成熟[19]。綜上表明，PP2C作為調節因子直接或間接參與逆境脅迫的信號轉導。到目前為止，植物中對于PP2C的報道主要集中于擬南芥、水稻等植物[4，20-21]。Schweighofer等[4]報道了擬南芥中有76個PP2C基因，Xue等[21]報道了水稻中有78個PP2C基因，但其中絕大部分基因的功能還未得到深入的研究。玉米上PP2C基因的克隆及功能驗證研究較少[17]，還有很多PP2C基因未被克隆及分析。為此，以抗旱性較強的玉米自交系豫882為材料，進行轉錄組測序分析，篩選受干旱誘導強烈上調表達的PP2C基因,然后采用同源克隆方法克隆基因，并進行生物信息學及表達模式分析，初步探討PP2C基因在逆境脅迫下的響應，為玉米抗逆遺傳改良提供基因資源。

1 材料和方法

1.1 植物材料與處理

供試材料為玉米抗旱自交系豫882，由河南農業大學陳彥惠教授實驗室饋贈。

挑選籽粒圓潤飽滿、大小較為一致的玉米種子，播種于裝有營養土的花盆中，在自然條件下生長到三葉一心時，對玉米根、莖、葉分別進行取樣，用于基因組織特異性表達分析。

挑選大小一致的玉米種子，種于用 Hoagland′s營養液澆透的營養土中，在溫室中(26 ℃/22 ℃、16 h光照/8 h黑暗、相對濕度70%)生長到三葉一心，將其從營養缽中連根部營養土一起輕輕拔起，用流動的自來水沖洗干凈，然后對幼苗進行以下處理。干旱處理：將玉米幼苗置于含有20% PEG6000的Hoagland′s營養液中，于處理0，2，4，8，12，24，48，60，72，84，96 h及復水(R)1，3 d隨機挑3株玉米幼苗分別取根、葉，將3株樣品等量混和，迅速置液氮中冷凍備用。ABA、NaCl處理：將玉米幼苗分別置于含有100 μmol/L ABA、200 mmol/L NaCl的Hoagland′s營養液中，于處理0，2，4，8，12，24，48，60，72，84，96 h分別取根、葉，迅速置液氮中冷凍備用。高溫處理：將玉米幼苗置于37 ℃培養箱中，處理0，2，4，8，12，24，48，60，72，84，96 h后分別取根、葉迅速置液氮中冷凍備用。以在正常溫室(溫度26 ℃/22 ℃)生長未進行處理的玉米幼苗為對照。

1.2 20%PEG6000脅迫處理轉錄組數據分析

將豫882干旱脅迫處理60，90 h及復水3 d的材料(以未處理材料為對照樣品)送廣州基迪奧生物科技有限公司利用Illumina HiSeq 2000進行測序, 獲得轉錄組數據。采用FPKM(Fragments per kilobase of exon model per million mapped reads)值反映基因的表達豐度，脅迫處理樣本與對照樣本基因表達量差異倍數以log2(FC)(Fold change)值表示。根據基因在不同處理時間后的表達量, 篩選在脅迫后表達量明顯上調、復水后表達量明顯下調的編碼PP2C的基因。

1.3 總RNA的提取和cDNA的合成

采用TRIzol(Invitrogen,USA)試劑提取樣品RNA，并檢測其質量。參照反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)的操作說明進行cDNA的合成，然后置于-80 ℃保存備用。

1.4 基因克隆

根據Phytozome數據庫中ZmPP2C6-01的同源序列，利用Primer Premier 5.0 軟件設計特異引物，引物為ZmPP2C6-01F1：5′-ATGGCCGAGATCTGCT GCGA-3′和ZmPP2C6-01R1：5′-TCATATGCCCCG GCGGAGAT-3′，以玉米cDNA 為模板，PCR 擴增ZmPP2C6-01的完整開放閱讀框(ORF)。PCR擴增體系 (25 μL)，LATaq(5 U/μL)0.2 μL、dNTP Mixture(10 mmol/L)2 μL、2×GC Buffer Ⅱ 2 μL、上、下游引物(10 μmmol/L)各1 μL、cDNA模板1 μL，用ddH2O補足至25 μL。 PCR擴增反應程序為:95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35個循環；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。將PCR擴增產物回收純化后，連接至pMD19-T載體后轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，經菌液PCR檢測挑取陽性單克隆，送往北京華大基因有限公司測序，利用DNAMAN軟件對測序結果進行比對分析。

1.5 生物信息學分析

根據ZmPP2C6-01基因的測序結果，利用 Seqman 軟件對基因全長進行拼接, 用Editseq 進行ORF查詢及蛋白質分子質量和等電點分析；利用Gene Structure Display Server(GSDS 2. 0) (http: //gsds. cbi. pku. edu. cn /index．php) 對基因結構進行分析；利用SOPMA(http://www.expasy.org/tools/)預測蛋白質的二級結構；采用在線工具Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)進行蛋白質三級結構預測；利用Expasy(http://www.expasy.org/tools/protscale.html)對蛋白質的疏水性/親水性進行預測；利用DNAMAN和MEGA 5.1對不同物種PP2C蛋白的氨基酸序列進行比對分析，并構建系統進化樹；利用STRING(https://string-db.org/cgi/input.pl)預測ZmPP2C6-01的互作蛋白。

1.6 亞細胞定位載體的構建、轉化及綠色熒光蛋白(GFP)表達分析

用特異引物ZmPP2C6-01F2:5′-CTAGACTAGTATGGCCGAGATCTGCTGC-3′(劃線部分為SpeⅠ酶切位點)和ZmPP2C6-01R2:5′-TTGGCGCGCCATAT GCCCCGGCGGAGAT-3′(劃線部分為AscⅠ酶切位點)擴增ZmPP2C6-01基因，用SpeⅠ和AscⅠ雙酶切ZmPP2C6-01產物和表達載體pMDC83，然后用T4-DNA連接酶連接酶切產物，構建亞細胞定位載體，轉化并進行測序驗證。參照劉兆明等[22]方法，采用熱激法將正確的重組質粒轉至農桿菌EHA105感受態細胞中，再一次酶切測序驗證正確后，選取培養至四-六葉期健壯的本氏煙，將含陽性克隆的農桿菌重懸液用1 mL注射器浸染煙葉下表皮，48 h后將注射孔部位的葉片表皮組織制作成臨時玻片，倒置于共聚焦熒光顯微鏡下觀察本氏煙表皮細胞內GFP表達情況。

1.7 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

根據ZmPP2C6-01全長cDNA序列設計實時熒光定量PCR引物，前引物為ZmPP2C6-01F3:5′-GCTG TCCGTCGACCACAAG-3′，后引物為ZmPP2C6-01R3:5′-CGCTCCGTCACCGTTACCT-3′。以玉米18SrRNA基因為內參，其引物為18S1: 5′-CCTGCGGCTTAA TTGACTC-3′，18S2:5′-GTTAGCAGGCTGAGGTCT GG-3′。熒光定量PCR反應在Bio-Rad CFX96 熒光定量PCR儀中進行，熒光定量PCR反應體系及反應程序參考SYBR Premix ExTaqTM(TaKaRa)試劑盒說明書，PCR體系(20 μL)含：SYBR Premix ExTaqⅡ10 μL，正、反向引物(10 μmmol/L)各1 μL，cDNA模板1 μL，用ddH2O補足至20 μL。反應程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40個循環。根據 2-ΔΔCt法[23]計算基因相對拷貝數。

2 結果與分析

2.1 干旱強烈誘導表達編碼PP2C基因的篩選

通過GO基因功能注釋結果篩選到響應干旱脅迫的差異表達的編碼PP2C的基因8個，對20%PEG6000處理樣本和對照樣本進行差異表達分析(表1)發現，除脅迫處理60，96 h的GRMZM2G057907與脅迫處理96 h的 GRMZM2G082487外，其他基因均上調表達；在復水3 d后，8個編碼PP2C基因的表達量均低于對照。其中，GRMZM2G057907、GRMZM2G010298、GRMZM2G108309、GRMZM2G155991均只在1個時間點達到顯著水平；而GRMZM2G059453在60，96 h均達到顯著水平；GRMZM2G082487在60 h、復水3 d時均達到顯著水平；GRMZM2G134628、GRMZM2G166297在96 h、復水3 d達到顯著水平，因GRMZM2G166297在脅迫60，96 h的表達量及log2(FC)值大于GRMZM2G134628，而復水3 d的 log2(FC)小于GRMZM2G134628，在干旱脅迫下響應強烈，整體呈升-升-降的表達趨勢。本研究以GRMZM2G166297為對象，對其進行進一步研究發現，其編碼的蛋白為PP2C6，故命名為ZmPP2C6-01。

表1 8個編碼PP2C基因的差異表達分析Tab.1 Differential expression analysis of 8 coding PP2C genes

注：不同字母表示差異顯著性(P<0.05)。

Note：Different letters indicate significant differences (P<0.05).

2.2 ZmPP2C6-01基因的克隆及其編碼蛋白質結構分析

以特異引物ZmPP2C6-01F1/R1進行PCR擴增，產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測發現，目的片段為1 242 bp(圖1)，經回收純化，連接至PMD19-T載體，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，挑取正確的陽性克隆送公司測序。

M.DL2000 DNA Marker；1.cDNA的PCR產物。M.DL2000 DNA Marker;1.PCR product of cDNA.

對ZmPP2C6-01基因結構進行分析發現，該基因有4個外顯子、3個內含子，CDS(Coding sequence)全長為1 242 bp，5′UTR為234 bp，3′UTR為220 bp，共編碼413個氨基酸，編碼的蛋白質分子質量為43.8 ku，等電點為6.6(圖2-A)。二級結構分析表明，ZmPP2C6-01含43.58%的α-螺旋、12.84%的延伸鏈、5.57%的β-轉角和38.01%的不規則卷曲(圖2-B)，由此可知，ZmPP2C6-01蛋白主要由α-螺旋和無規則卷曲組成。預測ZmPP2C6-01 的三級結構(圖2-C)發現，ZmPP2C6-01蛋白中包含α-螺旋、β-轉角、延伸鏈和無規則卷曲。對ZmPP2C6-01氨基酸序列的親水性/疏水性進行預測(圖2-D)發現，ZmPP2C6-01氨基酸序列中親水性氨基酸所占比例高于疏水性氨基酸，因此，整個肽鏈表現為親水性，ZmPP2C6-01蛋白為親水性蛋白。

2.3 ZmPP2C6-01 氨基酸序列比對及進化樹分析

對ZmPP2C6-01氨基酸序列進行同源性搜索，選擇同源性較高的其他4種植物的PP2C蛋白進行多序列比對和同源性分析發現，參比序列均含有一個非常保守的PP2C蛋白結構域，同時ZmPP2C6-01的氨基酸序列長度與其他物種PP2C蛋白序列長度相近，ZmPP2C6-01氨基酸序列與高粱、玫瑰草、哈氏黍、粟PP2C蛋白氨基酸序列同源性分別達85%，81%，79%，78%(圖3)。進化樹分析顯示，ZmPP2C6-01與高粱的PP2C蛋白親緣關系最近，玫瑰草、哈氏黍、粟依次次之；而與冬小麥、粗山羊草等的PP2C蛋白親緣關系相對較遠(圖4)。

A.基因結構分析；B.蛋白質二級結構預測；C.蛋白質三級結構預測；D.蛋白質親水性/疏水性預測。B中長豎線區.α螺旋；中豎線區.延伸鏈；次中豎線區.β-轉角；短線區.無規則卷曲。A.Gene structure analysis; B.Protein secondary structure prediction; C.Protein tertiary structure prediction; D.Protein hydrophilicity/hydrophobicity prediction.B:Long vertical bar area.α-helix; Medium vertical bar area.Extended strand; Sub-medium vertical bar area.β-turn; Short vertical bar area.Random coil.

圖3 ZmPP2C6-01蛋白與多種植物PP2C蛋白的多序列比對分析Fig.3 Multiple sequence alignment of ZmPP2C6-01 and PP2C proteins from other plants

圖4 ZmPP2C6-01蛋白的進化樹分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis of ZmPP2C6-01 protein

2.4 ZmPP2C6-01的互作蛋白預測

利用在線預測與ZmPP2C6-01互作的蛋白發現(表2)，與ZmPP2C6-01互作系數較高的編碼相關蛋白的基因有5個，分別編碼假設蛋白、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，互作系數介于0.924～0.973。

2.5 ZmPP2C6-01編碼蛋白的亞細胞定位分析

煙草下表皮亞細胞定位結果(圖5)表明，在含有對照載體pMDC83-GFP的煙草細胞膜、細胞質和細胞核中均發現了綠色熒光；而對于含有pMDC83-ZmPP2C6-01-GFP 融合表達載體的煙草來說，主要在細胞核中發現了綠色熒光，說明ZmPP2C6-01定位于細胞核中。

表2 ZmPP2C6-01互作蛋白分析Tab.2 Analysis of ZmPP2C6-01 interacting protein

圖5 ZmPP2C6-01在煙草表皮中的亞細胞定位Fig.5 Subcellular localization of ZmPP2C6-01 in tobacco epidermis

2.6 ZmPP2C6-01的表達分析

2.6.1 組織特異性表達分析 基因在植物組織中的富集表達部位與其功能密切相關, 為了研究玉米ZmPP2C6-01基因的功能，對玉米根、莖、葉中ZmPP2C6-01基因的表達水平進行分析(圖6)發現，ZmPP2C6-01基因在根中的表達量最高，其次是葉，莖中的表達水平最弱。其中，ZmPP2C6-01基因在根中的表達量是莖的7.3倍，是葉的2.3倍，這暗示ZmPP2C6-01基因可能在根中發揮更重要的作用。

圖6 ZmPP2C6-01基因在玉米不同組織中的表達水平Fig.6 Expression level of ZmPP2C6-01 gene in different tissues of maize

2.6.2 脅迫表達分析

2.6.2.1 20%PEG6000 由圖7可知，在20%PEG6000脅迫條件下，ZmPP2C6-01基因在根中的表達量大部分時間點均高于對照，脅迫8 h達到峰值，是對照的8.8倍，脅迫處理96 h后進行復水，復水1～3 d表達量迅速下降，均低于對照；ZmPP2C6-01基因在葉中的表達量均高于對照，在脅迫24～84 h表達量隨著脅迫時間的延長逐漸增加，于84 h達到最大值，復水1～3 d表達量上升，均高于對照。

圖7 20% PEG6000脅迫條件下ZmPP2C6-01基因的表達分析Fig.7 Expression analysis of ZmPP2C6-01 gene under 20% PEG6000 stress condition

2.6.2.2 100 μmol/L ABA 100 μmol/L ABA脅迫條件下，ZmPP2C6-01基因在根中的表達量整體上低于對照(8 h除外)；ZmPP2C6-01基因在葉中的表達量均高于對照，2 h受誘導表達程度最大，在12～84 h表達量相對比較穩定，96 h表達量升高(圖8)。

圖8 ABA脅迫條件下ZmPP2C6-01基因的表達分析Fig.8 Expression analysis of ZmPP2C6-01 gene under ABA stress condition

2.6.2.3 200 mmol/L NaCl 在200 mmol/L NaCl脅迫條件下，玉米幼苗于脅迫處理84 h后死亡。在脅迫處理過程中，ZmPP2C6-01基因在根中的表達量在大部分時間點均低于對照(8,60 h除外)；0～60 h，ZmPP2C6-01基因在葉中的表達量相對比較穩定，之后表達量急劇上升，在84 h表達量最高(圖9)。

圖9 鹽脅迫條件下ZmPP2C6-01基因的表達分析Fig.9 Expression analysis of ZmPP2C6-01 gene under NaCl stress condition

2.6.2.4 高溫 在高溫(37 ℃)脅迫條件下，ZmPP2C6-01基因在根中的表達量整體上低于對照；ZmPP2C6-01基因在葉中的表達量均高于對照，隨著脅迫處理時間的延長，受誘導表達程度先降低后逐漸增強，96 h達到最大(圖10)。

圖10 高溫脅迫條件下ZmPP2C6-01基因的表達分析Fig.10 Expression analysis of ZmPP2C6-01 gene under high temperature stress

3 結論與討論

本研究從玉米干旱脅迫轉錄組中篩選出8個響應干旱脅迫的PP2C蛋白基因，通過基因表達分析表明，ZmPP2C6-01(GRMZM2G166297)在干旱脅迫下被強烈誘導表達。利用同源克隆技術成功克隆了ZmPP2C6-01基因，經生物信息學軟件分析發現，該基因完整的開放閱讀框為1 242 bp，編碼413個氨基酸，其編碼的蛋白質含43.58%的α-螺旋、12.84%的延伸鏈、5.57%的β-轉角和38.01%的不規則卷曲，為親水性蛋白。ZmPP2C6-01蛋白與高粱的PP2C蛋白同源性最高，親緣關系最近。亞細胞定位結果顯示，ZmPP2C6-01蛋白定位于細胞核中，這與鄧克勤等[24]的擬南芥PP2C蛋白定位在細胞核的研究結果一致。

官曉敏[25]發現，LjPP2C在百脈根的不同組織中均有表達，但表達量卻不相同，主要在葉和根中表達，其次是接種的根瘤菌，在莖中的表達量低。PdPP2C基因在歐美楊的不同組織中差異表達，表達水平表現為根>功能葉>頂端葉>莖[26]。說明這些基因屬于組成型表達基因，且功能存在明顯差異。本研究中，ZmPP2C6-01基因的組織特異性表達分析結果表明，該基因在根中的表達量最高，其次是葉，在莖中的表達量最少。說明該基因通過特異的分子表達機制參與植物組織的生長發育。

本研究結果表明，ZmPP2C6-01基因在不同非生物脅迫條件下或同一非生物脅迫條件下不同部位中的表達模式均不一致。胡曉麗[27]對ZmPP2C2基因進行Northern雜交分析發現，玉米幼苗進行PEG處理后，該基因在根系中的表達量明顯強于對照。顏彥等[28]發現，在非生物脅迫條件下，二穗短柄草葉中BdPP2C2基因顯著被PEG和低溫脅迫誘導表達。Liu等[29]報道，在干旱和鹽處理下，PP2CG1基因在擬南芥的芽中上調表達，暗示AtPP2CG1正調控植物的耐鹽性。本研究結果發現，在干旱脅迫下，ZmPP2C6-01基因在根中的表達量大部分時間點高于對照，脅迫8 h達到峰值，同時在葉中上調表達，在脅迫24～84 h表達量隨著脅迫時間的延長總體上逐漸增加，于84 h達到最大值。在ABA、NaCl、高溫脅迫下，ZmPP2C6-01基因在根中大部分時間點的表達量均低于對照，整體呈下降趨勢，在葉中的表達量均高于對照，呈上調表達模式。而王培龍等[30]研究發現，在非生物脅迫下，剛毛檉柳ThPP2C基因在其不同部位及不同處理下差異表達，在干旱(20%PEG6000)處理后的根中呈下調表達模式，而在葉中，脅迫早期差異不明顯，48 h達到高峰，與ZmPP2C6-01被PEG處理下整體呈上調表達趨勢相一致；鹽漬(NaCl)、脫落酸(ABA)和茉莉酸(JA)處理后，ThPP2C基因在根中均表現為上調表達，而在葉中均表現為下調表達。徐云峰[31]研究發現，干旱、低溫脅迫均抑制ZmPP2C-A10基因在玉米根系中的表達，在脅迫處理過程中該基因表達水平與脅迫時間呈負相關；而在復水階段，該基因表達量又逐漸恢復到正常水平。綜上所述，ZmPP2C6-01基因可能參與玉米的抗旱、耐鹽及ABA、高溫應答反應，但具體調控途徑不同。在后續研究中將繼續對ZmPP2C6-01基因在玉米抗逆過程中的具體功能和作用機制進行分析。